中草药  2016, Vol. 47 Issue (11): 1968-1973
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.026
杨燕梅, 马晓辉, 卢有媛, 吕培霖, 林丽, 王振恒, 晋玲, 朱田田 . UPLC法测定7种秦艽中7种指标成分的量[J]. 中草药, 2016, 47(11): 1968-1973.
YANG Yan-mei, MA Xiao-hui, LU You-yuan, LV Pei-lin, LIN Li, WANG Zhen-heng, JIN Ling, ZHU Tian-tian . Contents of seven indicative constituents in seven kinds of Gentiana macrophylla by UPLC[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(11): 1968-1973 .
UPLC法测定7种秦艽中7种指标成分的量
杨燕梅1, 马晓辉1, 卢有媛1, 吕培霖3, 林丽1,2, 王振恒1,2, 晋玲1,2, 朱田田1,2     
1. 甘肃中医药大学, 甘肃 兰州 730000 ;
2. 中(藏)药资源研究所, 甘肃 兰州 730000 ;
3. 中国人民解放军第二十五医院, 甘肃 酒泉 735000
收稿日期: 2015-11-10
基金项目: 中央本级重大增减支项目"名贵中药资源可持续利用能力建设"子课题"秦艽全国生产区划研究"(20603020212);"秦艽质量特征和商品规格研究"(20603020110);2015年甘肃省高等学校科学研究项目"濒危中(藏)药麻花秦艽遗传分子与药效成分相关性研究"(2015A-098)
作者简介: 杨燕梅(1987-),女,在读硕士,研究方向为中药资源开发与质量综合评价。Tel:13609360140 E-mail:371694875@qq.com
通信作者: 晋玲(1974-),女,陕西韩城人,博士生导师,教授,研究方向为珍稀濒危和大宗常用中药资源可持续利用。Tel:13659428030 E-mail:1131858632@qq.com
摘要: 目的 建立秦艽中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷测定的UPLC方法。 方法 采用色谱柱ACQUITY UPLC® BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7μm);流动相甲醇-0.04%磷酸水溶液梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min;检测波长242 nm;柱温30℃。 结果 马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷分别在2.100~537.100、1.050~270.000、0.920~236.000、11.100~2830.000、0.750~192.000、0.167~102.000、0.216~52.800μg进样量与峰面积积分值线性关系良好(r ≥ 0.9995),平均回收率97.83%~100.08%,RSD ≤ 3.76%。 结论 UPLC较HPLC更简便、更有效,可用于秦艽中7种指标成分的同时测定。
关键词: 秦艽组     UPLC     HPLC     马钱苷酸     獐牙菜苦苷     6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷     龙胆苦苷     獐牙菜苷     异荭草苷     异牡荆苷    
Contents of seven indicative constituents in seven kinds of Gentiana macrophylla by UPLC
YANG Yan-mei1, MA Xiao-hui1, LU You-yuan1, LV Pei-lin3, LIN Li1,2, WANG Zhen-heng1,2, JIN Ling1,2, ZHU Tian-tian1,2     
1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China ;
2. Research Institute of Chinese(Tibetan) Medicinal Resources, Lanzhou 730000, China ;
3. The 25th hospital of Chinese People's Liberation Army, Jiuquan 735000, China
Abstract: Objective An ultra performance liquid chromatographic (UPLC) method was developed for simultaneously determining seven constituents, such as loganic acid, swertiamarin, 6'-O-β-D-glucosyl gentiopicroside, gentiopicroside, sweroside, isoorientin, and isovitexin, from the medicinal plants of Gentiana macrophylla. Methods The separation was performed on an Acquity UPLC® BEH C18 column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) through a gradient elution of methanol -0.04% aqueous phosphorite at a flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was 242 nm, and the column temperature was set at 30℃. Results For the seven analytes, loganic acid, swertiamarin, 6'-O-β-D-glucosyl gentiopicroside, gentiopicroside, sweroside, isoorientin, and sovitexin, a good linearity (r≥0.9995) was obtained in the range of 2.100-537.100, 1.050-270.000, 0.920-236.000, 11.100-2830.000, 0.750-192.000, 0.167-102.000, and 0.216-52.800 μg, respectively. Their average recoveries (n=6) were 97.83%-100.08%, respevtively, with RSD values less than or equal to 3.76%. Conclusion The UPLC method is simpler and more effective than HPLC, and can be used for the simultaneous determination of seven indicative constituents in medicinal plants of G. macrophylla.
Key words: Gentiana macrophylla Pall.     UPLC     HPLC     loganic acid     swertiamarin     6'-O-β-D-glucosyl gentiopicroside     gentiopicroside     sweroside     isoorientin     isovitexin    

秦艽是我国重要的传统中药之一，为抗风湿之要药，始载于《神农本草经》，列为中品。秦艽Gentiana macrophylla Pall.属于龙胆科（Gentianaceae）龙胆属Gentiana (Tourn.) L. 植物，全世界约20种。甘肃分布有9个种，经测定，其龙胆苦苷含量都达到《中国药典》的要求[1-4]。新疆分布4个特有种，其龙胆苦苷量也符合《中国药典》要求[5-6]。另外，在西藏广泛分布的西藏秦艽，也常作为习用品用[7]。所以，秦艽组药用植物种类多，分布广泛，极易造成入药混乱。前期研究者多采用HPLC法测定指标成分分析秦艽质量，指标成分多选择4种环烯醚萜苷类（马钱苷酸、龙胆苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷）。李荣娇等[8]建立了测定西藏秦艽花和川西秦艽花中落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆黄素7种成分的HPLC方法。而超高效液相色谱（UPLC）较HPLC柱子更短、更细、填料粒径也更小，有学者同时采用HPLC和UPLC测定了土茯苓、川芎、黄芩等药材中的指标成分，比较得出UPLC法更能节省分析时间和溶剂的耗损，具有速度更快、准确度更高、灵敏度更高的优势[9-11]。张明燕[12]采用UPLC对四川省松潘地产粗茎秦艽、秦艽、麻花秦艽中马钱苷酸和龙胆苦苷的量进行了测定，但所测指标较少。本实验收集了秦艽G. macrophylla Pall.、粗茎秦艽G. crassicaulis Duthie ex Burk.、麻花秦艽G. straminea Maxim.、小秦艽G. dahurica Fisch.、黄管秦艽G. officinalis H. Smith、管花秦艽G. siphonantha Maxim. ex Kusnez. 和长梗秦艽G. waltonii Burk. 7种药用植物，其中秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽、小秦艽为药典规定品种，其他3个为习用品种。本实验采用UPLC法同时测定了7种秦艽中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷的量，从而为秦艽的质量控制提供更有效的研究方法。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Thermo Fisher U-3000 RSLC超高效液相色谱仪；FW200高速万能粉碎机；Al104电子分析天平（万分之一，上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；OHAUS Corporation DV SERIES型电子天平（十万分之一，奥豪斯仪器有限责任公司）；DHG-9123A电热鼓风恒温干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；KQ-250TDB型高频数控超声波清洗器（昆仑山超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（赛默飞世尔科技有限公司集团，色谱纯）、磷酸（天津市大茂化学试剂厂，色谱纯）、水（屈臣氏蒸馏水）、其余试剂均为分析纯。对照品：龙胆苦苷（批号110770-201314，质量分数≥98%）购于中国食品药品检定研究院；马钱苷酸（批号MUST-15012207，质量分数≥98%）和异牡荆苷（批号140914，质量分数＞98%）购于北京世纪奥科生物技术有限公司；獐牙菜苦苷（批号K01024CD14，质量分数≥98%）、獐牙菜苷（批号PN1125SA13，质量分数≥98%）、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷（批号P26M6S1，质量分数≥98%）和异荭草苷（批号Y01023SA13，质量分数≥98%）购于上海源叶生物技术有限公司。

1.3 材料

药材均为自采，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为秦艽Gentiana macrophylla Pall.、粗茎秦艽G. crassicaulis Duthie ex Burk.、麻花秦艽G. straminea Maxim.、小秦艽G. dahurica Fisch.、黄管秦艽G. officinalis H. Smith、管花秦艽G. siphonantha Maxim. ex Kusnez. 和长梗秦艽G. waltonii Burk.。样品信息见表 1。

表 1 样品信息 Table 1 Sample information

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇-0.04%磷酸水溶液，梯度洗脱程序见表 2；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长242 nm；进样量1 μL。

表 2 流动相线性梯度 Table 2 Linear gradient of mobile phase

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品龙胆苦苷14.15 mg、马钱苷酸2.69 mg、獐牙菜苦苷1.34 mg、獐牙菜苷0.96 mg、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷1.18 mg、异荭草苷0.61 mg、异牡荆苷0.26 mg，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

将1～7号秦艽的根粉碎，过60目筛。精密称取粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率200 W，频率70 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置。精密量取上清液1 mL，置5 mL量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系的考察

分别取马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷储备液1 mL，置于5 mL量瓶中，配比稀释法，依次从5 mL的储备液中量取1.25 mL，置于5 mL的量瓶，连续稀释5次。取异荭草苷和异牡荆苷储备液1 mL，置于5 mL量瓶，依次从5 mL的储备液中量取2.5 mL置于5 mL的量瓶中，连续稀释6次。将7种对照品分别配制成系列浓度的溶液，在上述色谱条件下依次进样，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 3。

表 3 线性关系考察结果 Table 3 Results of linear relationship

2.4.2 精密度试验

精密吸取4号秦艽样品供试品溶液1 μL，连续进样6次，测得马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷峰面积的RSD分别为0.39%、0.41%、1.35%、0.15%、2.78%、3.23%、3.78%。

2.4.3 重复性试验

取4号秦艽样品粉末6份，每份0.5 g，按上述供试品溶液的制备方法，依法测定。测得马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷质量分数的RSD分别为0.75%、1.18%、0.83%、1.01%、2.76%、3.42%、3.76%。

2.4.4 稳定性试验

取4号秦艽样品供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样1 μL，测定峰面积，测得马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷峰面积的RSD分别为1.68%、2.27%、1.03%、1.87%、2.98%、3.89%、3.67%。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取已测定的小秦艽样品6份，分别加入一定量的马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷对照品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，然后进样1 μL，计算平均回收率。马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷的平均回收率为99.79%、98.70%、100.08%、99.55%、99.92%、98.73%、97.83%，RSD为1.68%、2.27%、1.03%、1.87%、2.98%、3.76%、3.45%。

2.5 样品测定

分别精密吸取含龙胆苦苷0.366 mg/mL、马钱苷酸0.219 mg/mL、獐牙菜苦苷0.093 mg/mL、獐牙菜苷0.222 mg/mL、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷0.084 mg/mL、异荭草苷0.086 mg/mL、异牡荆苷0.102 mg/mL的混合对照品溶液和1～7号供试品溶液各1 μL，注入超高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定。对照品和供试品的色谱图见图 1。利用线性回归方程计算7份秦艽样品中7种指标成分，结果见表 4。

图 1 混合对照品和秦艽样品色谱图 Fig.1 Chromatogram of mixed reference substances and samples

表 4 7种秦艽中7种指标成分的量 (n = 3) Table 4 Contents of seven kinds of index components of seven kinds G. macrophylla (n = 3)

3 结果与讨论 3.1 色谱条件的选择 3.1.1 流动相体系的选择

实验中依据样品的化学成分，考察了不同流动相体系：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.5%甲酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.04%磷酸溶液、乙腈-0.04%磷酸溶液等，进行等度洗脱，结果以甲醇-0.04%磷酸溶液体系得到的色谱峰峰形更为尖锐对称。

3.1.2 流动相梯度的选择

以甲醇-0.04%磷酸溶液为流动相，变换流动相初始比例、流动相比例变化梯度，并在谱峰较多的阶段逐渐放缓甲醇的比例变化梯度。最终选择甲醇-0.04%磷酸水溶液的洗脱梯度（0～6 min，95%～83% B；6～9 min，83%～82% B；9～17 min，82%～65% B；17～18 min，65% B；18～21 min：65%～95% B）。在此条件下，在相对较短的时间内获得良好的分离度。

3.1.3 检测波长的选择

在上述色谱条件下对进样后的对照品溶液在190～400 nm进行全波长扫描，结果马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷的最大吸收波长分别是240 nm，250 nm，250、275 nm，250、275 nm，240 nm，270、348 nm，270、332 nm。考虑到在242 nm检测波长下，各指标成分色谱峰峰面积都较大，选择242 nm作为检测波长。

3.2 供试品制备方法的筛选 3.2.1 提取方法的筛选

分别采用超声法和加热回流法进行样品的提取，并比较了二者的提取效果。结果显示，2种提取方法7种指标性成分量总和相差不大，但超声提取法更为简便，故选用超声提取法。

3.2.2 提取溶剂的筛选

分别加入甲醇、乙醇和丙酮，采用上述超声提取法制备供试品溶液，进样，测定含量。经综合考虑色谱峰的峰形、分离度及指标成分的提取量，最终选择甲醇为最佳提取溶剂。

3.2.3 提取时间的筛选

采用上述超声提取法制备供试品溶液，提取时间分别设为20、30、40、50、60 min。然后进样，测定各指标峰面积积分值。结果，提取时间20～40 min，各指标成分提取量快速增加，在40 min之后，龙胆苦苷和马钱苷酸提取量已非常稳定，獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷虽略有增加，但变化微小。到60 min时，龙胆苦苷提取量有明显减小。综合考虑7种指标成分提取量总和，选择最佳提取时间为40 min。

3.2.4 提取溶剂甲醇体积分数的选择

分别加入不同体积分数的甲醇溶液，甲醇-水为40%、60%、70%、80%、90%、100%，采用上述超声提取法制备供试品溶液，进样，测定各指标峰面积积分值。结果，甲醇体积分数为40%～70%时，7种指标成分提取量增加较快，在80%时，龙胆苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐牙菜苷和异牡荆苷的提取量有所下降，而马钱苷酸、獐牙菜苦苷和异荭草苷的提取量达到最大。综合考虑7种指标成分的峰面积总和，70%是甲醇溶液最佳提取体积分数。

3.2.5 提取料液比筛选

精密称取4号样品0.5 g，分别加入70%的甲醇溶液10、15、20、25、30、35 mL，采用以上超声法制备供试品溶液，进样，测得峰面积。结果，在0.5g样品中加入10～20 mL甲醇溶液时，各指标成分提取量增加较快，继续增加提取溶液体积，在25 mL时，龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和异牡荆苷提取量略有增加，其他指标成分已达最大。7种指标成分峰面积总和也在提取液为25 mL时达到最大，不再增加。综合以上，选择0.5 g样品中加入25 mL 70%甲醇溶液，为最佳料液比。

最后把收集的秦艽组7种药用植物（秦艽、麻花秦艽、小秦艽、麻花秦艽、黄管秦艽、管花秦艽和长梗秦艽）按该条件制备了供试品溶液，进样，测定了马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷的量，得出7种指标成分量总和：大秦艽＞黄管秦艽＞粗茎秦艽＞管花秦艽＞长梗秦艽＞麻花秦艽＞小秦艽。因此证明，秦艽组这7种药用植物都可采用该方法测得以上7种指标成分量。

3.3 小结

李荣娇等[9]采用HPLC研究了西藏秦艽花与川西秦艽花中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆黄素的量，共用时85 min；宋九华等[13]采用HPLC法同时测定粗茎秦艽中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷和异牡荆苷的量，共用时80 min；本实验所采用的UPLC法同时测定了7种指标成分，共用时18 min，可见UPLC较HPLC法检测的效率更高。而且，本实验UPLC方法学考察的RSD也略低于HPLC，可得UPLC法更准确。因此，本实验建立的UPLC法同时测定以上7种指标成分的方法可更好地用于秦艽药材的检测。

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