马兜铃酸Ⅰ（aristolochic acid Ⅰ，AAI）是马兜铃酸（aristolochic acid，AA）的主要毒性成分，长期服用含此类物质的中药可导致马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）的发生^[1-2]，很多国家现已采取相应政策来管理含此类成分的中药，但仍有部分群体不恰当的服用含AA的中药，AAN病例还时有发生，阐明AAI致肾毒性的发病机制仍具有重要意义。

Micro RNAs（miRNAs）是一类在生物体内广泛存在的长度约22 nt的小分子非编码RNA，它可以通过与靶基因mRNA的靶位点结合，抑制蛋白的合成或诱导该基因mRNA的降解，从而参与基因的表达调控^[3]。目前miRNAs功能涉及到生物体的干细胞分化、分子免疫机制、细胞内信号转导、肿瘤发生及各种疾病和病毒感染等^[4-6]。已有研究显示，miRNAs与AA的基因毒性^[7]、肾近曲小管上皮细胞的周期阻滞^[8]等过程密切相关。本课题组前期研究发现大鼠给予AAI 2.25 mg/kg剂量条件下，肾脏就已出现明显的病变^[9]。本研究将采用miRNAs芯片法筛选出AAI致大鼠肾损伤后血清中表达明显发生变化的miRNAs，并预测相关靶基因，对部分miRNAs进行信号通路分析，从分子水平探讨AAN的发病机制。

8 周龄SD大鼠18只，清洁级，体质量220～250 g。合格证号SCXK（浙）2008-0033，购自浙江省实验动物中心。分笼饲养，周围环境通风，温度22～25 ℃、湿度50%～60%，动物实验操作严格按照《江苏省实验动物管理办法》规定执行。

AAI（质量分数≥98%，批号20130201），河南省科技医药研究所；Trizol试剂（美国Life Technologies公司）；氯仿（成都科龙化工试剂厂）；异丙醇（南京化学试剂有限公司）；DEPC水（上海碧云天生物技术研究所）；逆转录试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；PolyAcryl Carrier（美国MRC公司）；Quanti Fast SYBR Green PCR kit（德国Qiagen公司）；所有引物由上海生工生物工程有限公司提供。

荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）；梯度PCR仪（美国Applied Biosysterms公司）；多功能酶标仪（美国BioTek公司）；低温离心机（德国Eppendorf）；石蜡包埋机（日本樱花Tissue-TEK）；切片机（美国Thermo公司）。

18 只大鼠随机分为对照组（10%二甲基亚砜＋20%聚乙二醇600＋70%生理盐水）和AAI组（2.25 mg/kg）^[10]。大鼠于笼中适应性喂养3 d，自由进水，连续ip给药14 d，末次给药后禁食不禁水12 h，颈总动脉取全血6 mL，3 000 r/min离心后取血清，冻存备用；处死大鼠，迅速摘除肾脏，用PBS漂洗后，一侧肾脏放入10%甲醛中固定，用于病理检查分析，另一侧肾脏于液氮中保存，用于其他检测。

取肾组织，切成小块浸泡在4%中性甲醛溶液中3 d；用蒸馏水洗涤组织块后放入70%乙醇中过夜；经脱水、透明、石蜡包埋、切片后，用多聚赖氨酸封片于玻璃载玻片上，进行苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察AAI对大鼠肾组织损伤的情况。

对照组及AAI组各随机取3例样本的大鼠血清，采用Trizol法提取总RNA，其样本采用琼脂糖凝胶电泳进行质控分析，分光光度法进行定量分析。分离出的miRNAs，基于μParaflor^TM微流体miRNAs检测探针进行实验。取RNA样品5～8 μg，进行靶标制备，在总RNA3’端用Poly A聚合酶加上poly A尾，并用于荧光标记。杂交反应在μParaflo微流体芯片上过夜进行。RNA与相应探针杂交后，与标记特异性结合的Hy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。利用激光扫描仪（Axon GenePix 4000B，Molecular Device）采集杂交图像，并使用GenePix Pro 6.0图像分析软件进行图像数字化转换，并使用LOWESS过滤进行信号归一化。计算两种检测信号的比值和t检验的P值，以P＜0.05为差异有统计学意义，比值＞1.5为显著表达差异。整个杂交和分析实验由上海康成生物公司完成，合同编号H1311169。

根据microRNA生物信息学数据库miRBase（http://www.mirbase.org/）、miRDB（http://mirdb.org/ miRDB/）、miRanda（http://www.microrna.org- microrna/home.do）对miRNAs芯片中5个表达有明显差异的miRNAs进行检索，将结果导出并比对，将3个数据库中共有的基因作为核心靶基因。

miRNAs的反转录体系为20 μL，其中2×miRNA RT Solution mix 10 μL，miRNA RT Enzyme mix 2 μL，Total RNA/micro RNA 2 μg/100 ng，RNase-free water。反转录程序：37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃速冷。qRT-PCR反应体系20 μL，其中1 μL模板（逆转录产物），2 μL引物混合物（10 μmol/L），10 μL 2×SYBR green，7 μL水。反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40个循环。以U6为内参基因，以2^−ΔΔCt（C_t值代表循环阈值）表示基因的表达量，部分引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 用于miRNAs real-time PCR的部分引物 Table 1 Primers used to perform real-time PCR of miRNAs 引物 引物序列 (5’→3’) miR-10a-3p-RT CAAATTCGTATCTAGGGGAATA miR-10a-3p-F CGCAAATTCGTATCTAGGGGAA miR-3594-3p-RT CACACCGCCTCTGCCCGCTAGT miR-3594-3p-F CACACCGCCTCTGCCC miR-9a-3p-RT ATAAAGCTAGATAACCGAAAGT miR-9a-3p-F GCGCATAAAGCTAGATAACCGA U6-R AACGCTTCACGAATTGCGT U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA

表 1 用于miRNAs real-time PCR的部分引物 Table 1 Primers used to perform real-time PCR of miRNAs

根据KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes）数据库（http://www.genome.jp/kegg/），对芯片检测出的miRNAs靶基因进行信号通路显著性分析。分析结果采用Fisher精确检验和卡方检验进行统计，P＜0.05，FDR＜0.05则认为差异具有统计学意义。

采用GraphPad Prism 6软件进行相关统计分析，组间数据采用单因素方差分析，数据以x±s表示。

连续给药14 d后，取大鼠肾脏进行HE染色，光学显微镜下观察其病理改变。对照组大鼠肾脏肾小管未见水肿，间质血管未见充血和炎细胞浸润，肾皮质内肾小球未见充血，肾小球无硬化现象；AAI组肾脏肾小管上皮细胞轻度水样变性，间质血管轻度充血，偶见炎细胞浸润现象，已出现明显病变。结果见图 1。本课题组前期研究^[9]显示，2.25 mg/kg AAI连续ip给药14 d后，大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平明显升高（P＜0.05）；结合本实验结果说明2.25 mg/kg AAI可造成大鼠肾损伤。

图 1 AAI给药14 d后大鼠肾脏组织病理变化 Fig.1 Pathological changes in kidney tissue of rats after 14 d of AAI administration

AAI致大鼠肾损伤后，利用miRNAs芯片对对照组和AAI组大鼠血清进行检测，与对照组血清相比，miRNAs芯片筛选出5个差异表达明显上调的miRNAs，分别是miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p、miR-874-3p、miR-9a-3p，表达变化见图 2；此次芯片检测中无显著下调的miRNAs。

图 2 大鼠血清中差异表达显著上调的miRNAs Fig.2 miRNAs with significant up-regulation of differential expression in serum of rats

以U6为内参对芯片筛选出的差异表达的miRNAs进行qRT-PCR验证，记录C_t值，使用2^−ΔΔCt法计算结果并统计，结果显示与对照组相比，miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p表达均明显上调，miR-874-3p、miR-9a-3p表达呈升高趋势，如图 3所示，说明qRT-PCR结果与miRNAs芯片结果基本一致，本研究的芯片结果基本真实可靠。

图 3 各miRNA的qRT-PCR检测结果 Fig.3 Determination of qRT-PCR in each miRNA

对芯片筛选出的差异表达的5个miRNAs，通过miRBase、miRDB、miRanda 3种靶基因预测数据库预测该5种miRNAs的靶基因，选出在3种数据库中出现的基因作为潜在靶基因，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 miRNAs的靶基因预测 Table 2 Target gene prediction of miRNAs miRNA 靶基因 靶基因描述 miR-10a-3p Rhebl1 Ras homolog enriched in brain like 1 miR-10a-3p Usp10 ubiquitin specific peptidase 10 miR-207 Trim39 tripartite motif-containing 39 miR-207 Slco2b1 solute carrier organic anion transporter family,member 2b1 miR-207 Cdk9 cyclin-dependent kinase 9 miR-207 Tm2d2 TM2 domain containing 2 miR-9a-3p Mtfmt mitochondrial methionyl-tRNA formyltransferase miR-9a-3p Itgb1 integrin,beta 1 miR-9a-3p Tcea1 transcription elongation factor A (SII) 1 miR-9a-3p Onecut1 one cut homeobox 1 miR-9a-3p Myh10 myosin,heavy chain 10,non-muscle miR-9a-3p Stc1 stanniocalcin 1 miR-9a-3p Pfkm phosphofructokinase,muscle 1 miR-9a-3p Id4 inhibitor of DNA binding 4 miR-874-3p Slc6a18 solute carrier family 6,member 18 miR-874-3p Nr2c2 nuclear receptor subfamily 2,group C,member 2

表 2 miRNAs的靶基因预测 Table 2 Target gene prediction of miRNAs

根据预测出的靶基因，对其进行信号通路分析，AAI组大鼠与对照组相比较，差异miRNAs参与了多个信号通路的调节，富集度较高的为过氧化物酶体（rno04146）、MAPK信号通路（rno04010）、多巴胺能突触（rno04728）、黏蛋白型-O-多糖生物合成（rno00512）、酮体的合成与降解（rno00072）等途径，见图 4。

图 4 miRNA的Pathway分析 (部分) Fig.4 Pathway analysis of miRNA (part)

AA具有广泛的药理作用，具有抗感染、镇痛、利尿、抗生育活性、抗肿瘤及调节血压等功效^[11-12]，尽管AA可诱发AAN，引起了世人的警觉，但由于不合理的用药使得AAN事件时有发生，增强人们对AAN的认识和提高AAN的可治愈性仍是解决此类事件的关键。

近年来，miRNAs的功能研究越来越受到人们的重视，动物源miRNAs主要是通过与靶基因mRNA的3’端非编码区域（3’UTR）不完全或完全互配对结合，在翻译水平上特异性抑制基因的表达。miRNAs功能研究的关键在于其调控靶基因的确定，但由于miRNAs和靶基因的作用位点并不完全匹配，一个mRNA能被很多miRNAs调控，形成一个十分复杂的转录后调控网络，导致应用传统方法鉴定靶基因十分困难。miRNAs芯片技术能在特定的时间点筛选出不同样本间的差异miRNAs表达情况，是一种新型的高通量筛选技术，已在很多复杂性疾病的研究中进行探索并得到广泛的应用，如microRNA-206与乳腺癌的发病、转移密切相关^[13-14]，在AAN研究方面，已有研究显示，miRNAs与AA的基因毒性^[7]、肾近曲小管上皮细胞的周期阻滞^[8]等过程密切相关，但miRNAs在AA或AAI诱导的肾毒性疾病中其他发病过程的相关研究还未见报道。

本研究利用基因微阵列分析技术探索AAI对大鼠肾脏造成损伤后血清中miRNAs表达谱的影响，发现miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p、miR-874-3p、miR-9a-3p等5个miRNAs表达明显上调，无明显下调的miRNAs；利用qRT-PCR技术对芯片结果进行检验，该结果与miRNAs芯片结果基本一致，增加了本研究的可靠性，发生明显改变的miRNAs在AAI致大鼠肾损伤过程中的具体功能还有待研究。本课题组对差异表达miRNAs的靶基因进行预测及信号通路分析，寻找到Rhebl1、Usp10等多个潜在靶基因，并发现AAI致肾损伤与过氧化物酶体途径、MAPK信号通路途径等有很大关系，信号通路分析结果为AAN机制的深入研究提供了新方向的借鉴和理论基础，针对该结果，本课题组将对此次miRNAs芯片结果的生物信息学进行深入研究和验证，并做出充分的阐述。

通过以上研究，本课题组已初步找到一些可能与AAI致肾损伤相关的miRNAs和潜在靶基因，及相应的生物途径，这将为进一步阐明AAN的发病机制提供新的线索，为其预防、诊断和治疗提供新的依据。