银翘清热片（YQT）是由金银花、葛根、连翘、知母等9味药材的提取物加一定的赋形剂，按现代制剂工艺技术制成的片剂，具有辛凉解表、清热解毒之功效。经临床研究显示，YQT能减轻风热型感冒的症状，提高单项症状的消失率，使中医症状总分下降，且未发生不良事件和不良反应，证明了该制剂治疗风热型感冒的安全性和有效性^[1-2]。现行的质量标准对处方中的5味药材进行了薄层鉴别，并对4个指标成分进行了定量测定，但仍缺少整体评价的质控方法，不能满足中药现代化的质量控制要求。

中药指纹图谱是符合中药特色的评价方法，具有整体性、模糊性和特征性的显著特点，不仅可以定性鉴别，还能利用其进行整体定量，为中药材及中药制剂国内外广泛接受的一种中药质量评价技术^[3-7]。LC-MS技术结合了HPLC的高分离效能和MS的高灵敏度、高选择性使之成为药物研究中强有力的工具，在中药质控中得到越来越广泛的应用^[8-10]。本研究建立了YQT的HPLC指纹图谱，共标定了28个共有峰，将共有峰在药材中进行归属，并采用LC-MS对其化学成分进行分析鉴定，为YQT的物质基础研究提供了数据支撑。

Agilent1260高效液相色谱仪（配有四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）、Agilent 1290超高压液相色谱仪（配有二元泵、自动进样器、柱温箱、DAD紫外检测器）、Agilent 6538飞行时间质谱检测器（配有ESI源，Qualitative Analysis质谱分析软件）美国Agilent公司；BSA224S-CW型电子分析天平，德国Sartorius公司；XP6型电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q Advantage A₁₀纯水机，美国Millipore公司；KQ5200DA型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

乙腈、甲酸，色谱纯，美国天地公司；超纯水；其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。YQT共11批（批号分别为110301、110302、110303、110401、120601、120602、120603、120701、140401、140402、140403），江苏康缘药业股份有限公司。对照品葛根素（批号110752-200912，质量分数96.0%）、绿原酸（批号110753-201314，质量分数96.6%）、连翘苷（批号110821-200711，质量分数98.9%）、牛蒡苷（批号110819-200606，质量分数100%）、连翘酯苷A（批号111810-201104，质量分数94.3%）、大豆苷（批号111738-200501，质量分数100%）、大豆苷元（批号111502-200402，质量分数100%）、芦丁（批号100080-200707，质量分数90.5%）、芒果苷（批号111607-200402，质量分数100%）、知母皂苷B Ⅱ对照品（批号111839- 201303，质量分数93.2%），均购自中国食品药品检定研究院；对照品新绿原酸（批号MUST-13013001）、隐绿原酸（批号MUST-13013002）、异绿原酸A（批号MUST-13101101）、异绿原酸B（批号MUST- 13081402）、异绿原酸C（批号MUST-13081401），购自成都曼斯特生物技术有限公司，HPLC测定质量分数均≥98%；对照品断氧化马钱苷（批号140915），HPLC测定质量分数≥98%，购自成都普菲德生物技术有限公司。

色谱柱为Kromasil C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，线性洗脱程序为0～10 min，5%～10%乙腈；10～15 min，10%～11%乙腈；15～25 min，11%～13%乙腈；25～50 min，13%～20%乙腈；50～65 min，20%～32%乙腈；65～80 min，32%～60%乙腈；80～85 min，60%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长230 nm；进样量为10 μL。质谱检测时将0.1%磷酸水溶液更换为0.1%甲酸水溶液。

采用ESI源，正离子模式下：毛细管电压4 000 V，雾化气压力310.32 kPa（45 psi），干燥气体积流量10 L/min，加热毛细管温度350 ℃，碎片电压145 V，锥孔电压65 V，质量数扫描范围m/z 100～2 000；负离子模式下：毛细管电压3 500 V，雾化气压力310.32 kPa（45 psi），干燥气体积流量10 L/min，加热毛细管温度350 ℃，碎片电压145 V，锥孔电压65 V，扫描范围m/z 100～2 000。

取葛根素对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成含葛根素0.1 mg/mL的对照品溶液，即得。

取葛根素、大豆苷、大豆苷元、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、断氧化马钱苷、芦丁、连翘苷、连翘酯苷A、牛蒡苷、芒果苷、知母皂苷B Ⅱ对照品适量，加50%甲醇溶解，制成分别含葛根素15.8 μg/mL、大豆苷74.2 μg/mL、大豆苷元49.7 μg/mL、新绿原酸10.4 μg/mL、绿原酸29.8 μg/mL、隐绿原酸14.1 μg/mL、异绿原酸A 13.4 μg/mL、异绿原酸B 9.3 μg/mL、异绿原酸C11.7 μg/mL、断氧化马钱苷14.1 μg/mL、芦丁9.3 μg/mL、连翘苷13.0 μg/mL、连翘酯苷A 74.6 μg/mL、牛蒡苷57.8 μg/mL、芒果苷4.9 μg/mL、知母皂苷B Ⅱ 75.1 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

取重量差异项下的本品，研细，取约0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，密塞，超声处理（40 kHz，200 W）30 min，摇匀，离心，取上清液过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得。

取批号为140401批的YQT，按“2.3”项方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，重复进样6次，记录色谱图。以分离度好，且为本品功效成分的葛根素为参照峰，计算主要色谱峰(占总峰面积1%以上)的相对保留时间和相对峰面积。结果28个共有峰相对保留时间的RSD为0.0～0.16%，相对峰面积的RSD为0.0～1.15%，表明仪器精密度良好。

取同一供试品（批号140401）溶液，分别于制备后0、3、8、11、16、24 h进样，共记录6个时间点的指纹色谱图谱。以葛根素为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果28个共有峰相对保留时间的RSD为0.0～0.25%，相对峰面积的RSD为0.0～1.62%。结果表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

取YQT样品（批号140401），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，依法测定。以葛根素为参照峰，计算主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果28个共有峰相对保留时间的RSD为0.0～0.26%，相对峰面积的RSD为0.0～1.28%。结果表明该方法重复性良好。

取11批YQT，按“2.1”～“2.3”项下规定的方法进行测定，将其指纹图谱的AIA格式从仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统。选择10批YQT指纹图谱中均存在的色谱峰作为共有峰，共标定28个共有峰，用平均值计算法生成YQT的对照指纹图谱，见图 1。以此共有模式为标准，对样品进行整体相似度评价。结果11批制剂的相似度分别为0.997、0.997、0.997、0.982、0.995、0.995、0.995、0.976、0.989 、0.989、0.989。表明不同批次的YQT工艺稳定、质量一致性较好。

图 1 11批YQT HPLC指纹图谱及对照指纹图谱 (R) Fig.1 HPLC fingerprint of 11 batches of YQT and common fingerprint (R)

通过与处方中的9味药材制备的样品图谱比较，结果显示YQT指纹图谱中的成分主要来自葛根、金银花、连翘、牛蒡子、知母和升麻药材。其中1、15、17、18、19、23、26号峰来源于连翘，3、5、6、7、8、14、20、21、22号峰来源于金银花，2号峰来源于连翘和升麻，4、9（S）、11、12、13、24号峰来源于葛根，25、27、28号峰来源于牛蒡子，10号峰来源于知母，16号峰来源于升麻。见图 2。

图 2 YQT 指纹图谱中各共有峰归属色谱图 Fig.2 Fingerprint of characteristic of each common peak in YQT

采用正、负离子分别对供试品溶液进行扫描，结果显示在2种模式下，检测到的成分个数一致，且负离子模式下样品中大部分成分响应高于正离子模式下的信号（图 3）。通过对照品比对，结合紫外吸收曲线、MS数据和相关文献^[11-30]进行分析，鉴定出42个化学成分，其中16个化学成分为对照品比对鉴定。结合指纹图谱中共有峰的归属、各药味所含化学成分等信息，分析制剂中的8个异黄酮类成分来源于葛根，分别为化合物4、6、11、13、15、16、18、34；6个奎宁酸类成分和6个环烯醚萜类成分来源于金银花，分别为化合物3、7、10、26、27、29和8、9、14、17、19、20；4个苯乙醇苷类成分、2个木脂素类成分和2个其他类成分来源于连翘，分别为化合物5、21、22、23，25、33和1、2；1个黄酮类成分和6个甾体皂苷类成分来源于知母，分别为化合物12及28、30、32、36、37、38；6个木脂素类成分来源于牛蒡子，分别为化合物31、35、39、40、41、42；芦丁来源不好归属。42个化学成分的分子式、母离子测定值、理论值、误差、最大吸收波长（λ_max）、来源信息见表 1。

图 3 混合对照品 (A) 和YQT (B) 负离子模式TIC图 Fig.3 TIC of mixed reference substances (A) andYQT (B)in negative ion mode

表 1(Table 1)

表 1 YQT中化学成分UPLC-DAD-Q-TOF/MS数据及鉴定结果 Table 1 Information of identified compounds in YQT by UPLC-DAD-Q-TOF/MS 化合物 tR/min λmax/nm 母离子测定值 (m/z) 理论值 (m/z) 误差/×10−6 分子式 鉴定结果 指纹共有峰号 来源 1 5.2 225 315.108 5 [M－H]−1 315.108 5 0.17 C14H20O8 连翘酸-1′-O-β-D- 葡萄糖苷 1 连翘 361.114 4 [M＋HCO2]−1 361.114 0 −0.91 2 11.1 235 375.129 7 [M－H]−1 375.129 7 −0.20 C16H24O10 五福花苷酸 2 连翘 399.126 2 [M＋Na]+ 399.126 2 −0.19 3 12.9 327 353.087 9 [M－H]−1 353.087 8 −0.36 C16H18O9 新绿原酸 3 金银花 355.102 8 [M＋H]+ 355.102 4 −1.39 4 13.4 250 577.156 1 [M－H]−1 577.156 3 0.26 C27H30O14 葛根素-4′-O-葡 萄糖苷 葛根 579.170 5 [M＋H]+ 579.170 8 0.52 5 14.0 280 461.166 2 [M－H]−1 461.166 4 0.45 C20H30O12 连翘酯苷E 连翘 485.163 0 [M＋Na]+ 485.162 9 −0.09 6 18.2 250 431.098 1 [M－H]−1 431.098 4 0.73 C21H20O10 3-羟基葛根素 4 葛根 433.113 3 [M＋H]+ 433.112 9 −0.79 7 18.6 327 353.087 5 [M－H]−1 353.087 8 0.85 C16H18O9 绿原酸 5 金银花 355.102 4 [M＋H]+ 355.102 4 −0.12 8 19.5 235 389.108 9 [M－H]−1 389.108 9 0.05 C16H22O11 断马钱苷 6 金银花 413.106 2 [M＋Na]+ 413.105 4 −1.92 9 20.5 245 373.113 7 [M－H]−1 373.114 0 0.87 C16H22O10 断马钱子酸 7 金银花 397.110 8 [M＋Na]+ 397.110 5 −0.82 10 20.8 327 353.087 8 [M－H]−1 353.087 8 0.08 C16H18O9 隐绿原酸 8 金银花 11 25.1 250 415.103 4 [M－H]−1 415.103 5 0.23 C21H20O9 葛根素 9 (S) 葛根 12 25.7 254 421.077 6 [M－H]−1 421.077 6 0.19 C19H18O11 芒果苷 10 知母 13 26.3 245 547.145 4 [M－H]−1 547.145 7 0.65 C26H28O13 葛根素-6′-O-木糖苷 葛根 549.160 0 [M＋H]+ 549.160 3 −0.56 14 26.6 250 403.124 3 [M＋HCO2]−1 403.124 6 0.67 C16H22O9 獐牙菜苷 金银花 359.133 5 [M＋H]+ 359.133 7 0.55 15 27.2 250 445.113 9 [M－H]−1 445.114 0 0.40 C22H22O10 3-甲基葛根素 11 葛根 447.128 6 [M＋H]+ 447.128 6 0.00 16 28.2 250 547.145 9 [M－H]−1 547.145 7 −0.29 C26H28O13 葛根素芹菜糖苷 12 葛根 549.160 4 [M＋H]+ 549.160 3 −0.32 17 32.8 245 433.135 2 [M＋HCO2]−1389.144 3 [M＋H]+ 433.135 1 389.144 2 −0.11 −0.18 C17H24O10 表断马钱子苷半 缩醛内酯 金银花 18 33.5 250 461.108 6 [M＋HCO2]−1 461.108 9 0.70 C21H20O9 大豆苷 13 葛根 417.117 9 [M＋H]+ 417.118 0 0.14 19 34.0 235 403.124 6 [M－H]−1 403.124 6 −0.02 C17H24O11 断氧化马钱苷 14 金银花 427.121 2 [M＋Na]+ 427.121 1 −0.37 化合物 tR/min λmax/nm 母离子测定值 (m/z) 理论值 (m/z) 误差/×10−6 分子式 鉴定结果 指纹共有峰号 来源 20 34.6 245 433.135 2 [M＋HCO2]−1 433.135 1 −0.21 C17H24O10 断马钱子苷半缩 醛内酯 金银花 389.144 3 [M＋H]+ 389.144 2 −0.22 21 41.6 327 623.198 0 [M－H]−1 623.198 1 0.28 C29H36O15 阿克苷 15 连翘 647.194 4 [M＋Na]+ 647.194 6 0.46 22 43.7 350 611.160 7 [M＋H]+ 611.160 7 −0.09 C27H30O16 芦丁 23 45.3 327 623.198 0 [M－H]−1 623.198 1 0.30 C29H36O15 异连翘酯苷 17 连翘 642.239 9 [M＋NH4]+ 642.239 2 −1.08 24 46.0 327 623.198 1 [M－H]−1 623.198 1 0.12 C29H36O15 连翘酯苷A 18 连翘 642.239 4 [M＋NH4]+ 642.239 2 −0.32 25 49.9 230 519.187 5 [M－H]−1 519.187 2 −0.51 C26H32O11 (+)-表松脂素-4-O- β-D-葡萄糖苷 19 连翘 543.183 7 [M＋Na]+ 543.183 7 −0.01 26 51.6 327 515.119 6 [M－H]−1 515.119 5 −0.16 C25H24O12 异绿原酸B 20 金银花 27 53.5 327 515.119 5 [M－H]−1 515.119 5 −0.02 C25H24O12 异绿原酸A 21 金银花 28 56.0 − 935.486 0 [M－H]−1 935.485 7 −0.32 C45H76O20 知母皂苷E1 知母 959.481 7 [M＋Na]+ 959.482 2 0.65 29 57.3 327 515.119 6 [M－H]−1 515.119 5 −0.27 C25H24O12 异绿原酸C 22 金银花 30 57.6 − 917.475 4 [M－H]−1 917.475 2 −0.03 C45H74O19 知母皂苷D 知母 941.471 5 [M＋Na]+ 941.471 7 −0.02 31 58.6 280 519.186 9 [M－H]−1 519.187 2 0.62 C26H32O11 罗汉松脂素苷 牛蒡子 543.184 0 [M＋Na]+ 543.183 7 −0.67 32 61.3 − 919.490 9 [M－H]−1 919.490 8 −0.15 C45H76O19 知母皂苷B Ⅱ 知母 33 62.8 230 579.208 4 [M＋HCO2]−1 579.208 3 −0.14 C27H34O11 连翘苷 23 连翘 557.199 7 [M＋Na]+ 557.199 3 −0.62 34 63.3 250 253.050 7 [M－H]−1 253.050 6 −0.09 C15H10O4 大豆苷元 24 葛根 35 64.0 230 579.208 2 [M＋HCO2]−1 579.208 3 0.28 C27H34O11 牛蒡苷 25 牛蒡子 36 69.1 − 901.480 5 [M－H]−1 901.480 2 −0.16 C45H74O18 知母皂苷C 知母 903.494 9 [M＋H]+ 903.494 8 −0.05 37 69.3 − 901.480 2 [M－H]−1 901.480 2 −0.08 C45H74O18 知母皂苷B Ⅲ 知母 903.496 0 [M＋H]+ 903.494 8 −1.45 38 73.3 − 757.437 6 [M－H]−1 757.438 0 0.57 C39H66O14 知母皂苷Ⅰ 知母 781.433 8 [M＋Na]+ 781.434 5 0.96 39 73.9 280 535.197 5 [M－H]−1 535.197 4 −0.26 C30H32O9 牛蒡酚A 27 牛蒡子 559.193 6 [M＋Na]+ 559.193 9 0.52 40 74.1 280 535.197 5 [M－H]−1 535.197 4 −0.26 C30H32O9 异牛蒡酚A 牛蒡子 559.194 1 [M＋Na]+ 559.193 9 −0.56 41 75.1 280 713.260 6 [M－H]−1 713.260 4 −0.28 C40H42O12 牛蒡酚F 牛蒡子 737.256 5 [M＋Na]+ 737.256 8 0.50 42 75.4 230 371.150 0 [M－H]−1 371.150 0 0.02 C21H24O6 牛蒡苷元 28 牛蒡子 373.164 7 [M＋H]+ 373.164 6 −0.33 “*”为经过对照品确证的成分 “*” is composition confirmed after reference substance

表 1 YQT中化学成分UPLC-DAD-Q-TOF/MS数据及鉴定结果 Table 1 Information of identified compounds in YQT by UPLC-DAD-Q-TOF/MS

使用DAD检测器对样品进行190～600 nm全波长扫描，并对等吸收图进行分析，提取吸收峰较多的3个波长（230、280、330 nm）下的色谱图进行比较，显示230 nm检测波长能较全面地反映YQT中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，因此选择230 nm作为YQT指纹图谱的采集波长。考虑到金银花、连翘中含有大量有机酸类、苯乙醇苷类成分，选用乙腈-酸水系统进行研究。比较了乙腈-三氟乙酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液系统，结果显示乙腈-三氟乙酸水溶液基线漂移，乙腈-甲酸水溶液系统各成分响应较小，基线噪音高，因此选用乙腈-磷酸水溶液系统作为流动相。对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmmetry C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Luna C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果显示Kromasil C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）对样品的分离效果较好，用2支该类型的色谱柱进行实验，结果重复性较好，因此选择用该类型色谱柱为YQT指纹图谱分析柱。考察柱温为20、25、30、35 ℃所得图谱，结果柱温为20、25 ℃时各个成分分离度和色谱峰的对称性均较好，考虑到实验室和仪器的控温能力，选择柱温为25 ℃。

对供试品的提取方法、提取溶剂、提取时间和溶剂用量分别进行考察，结果显示超声与回流2种方式提取效果相当，考虑到超声提取操作简单易行，选择超声提取法。50%甲醇提取的样品信息较全面，选择50%甲醇为提取溶剂；超声20 min样品中各成分已提取充分，因此选择提取时间为20 min。溶剂用量在10～50 mL，各色谱峰均提取较充分，而溶剂用量为10 mL时，样品黏度大，难于处理，选择溶剂用量为25 mL。

实验测定的11批YQT指纹图谱相似度较好，但相对峰面积有一定的差异，结合定量测定中指标成分的转移率分析，制剂质量的差异性主要归因于投料药材质量的不均一，因此若要保证成品质量的稳定性，控制药材的质量均一性是非常必要的。

本研究建立了YQT指纹图谱，对照指纹图谱中的共有峰来源于处方中的6味药材，对制剂有较好的整体质控效果。并结合光谱信息、色谱信息及质谱信息对YQT中42个成分进行了鉴定，为深入研究YQT的物质基础和质量标准的提升提供有力的技术支持。但不足的是在指纹图谱中板蓝根、薄荷和蝉蜕的化学信息未得到体现，分析可能原因为以上3味药材专属性成分为挥发性或水溶性成分，在现有的洗脱条件和检测条件下，不能被检识，需在后续的研究中予以改进。