土鳖虫Eupolyphaga Steleophaga为鱉蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳖Steleophaga plancyi Boleny的雌虫干燥体^[1]。地鳖主产于北京、华中、华东、华南和西部各省区；冀地鳖分布于黄河北侧省地；赤边水蟅Opisthoplata orientalis Burm（习称金边地鳖）未被《中国药典》2015年版收录^[2]，为土鳖虫混淆品，但在浙江、福建、台湾、广东、海南等地^[3]常被作为土鳖虫入药。土鳖虫味咸，性寒，有小毒，归肝经，具破血逐瘀、续筋接骨的功效，用于闭经、不孕不育、产后瘀阻、症瘕等症；亦可用于骨折损伤、瘀滞疼痛、腰部扭伤等症^[4]。氨基酸是土鳖虫的主要组成成分之一，总量约占土鳖虫的40%，直接参与合成各种酶、激素，在活血化瘀疗效中起着一定的作用^[5]。土鳖虫中共含有18种氨基酸，种类齐全，几乎包含了构成蛋白质的所有氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸（包括婴儿必需的组氨酸）占氨基酸总量的34.5%。传统的氨基酸衍生化方法主要有柱前衍生法^[6]和柱后衍生法^[7]，但以上2种方法操作繁琐、费时。本实验建立了OPA-FMOC^[8]在线衍生化方法，测定了不同来源的土鳖虫及其混淆品中氨基酸的指纹图谱，为其质量评价提供了一定参考依据。

Agilent 1100高效液相色谱仪，包括四元泵、在线脱气机、柱温箱、DAD检测器、全自动进样（美国Agilent公司）；AB135-S十万分之一天平（Mettler Toledo仪器有限公司）；BP210S电子天平（Sartorius公司）；HC-2516高速离心机（科大创新股份有限公司）。

甲醇、乙醇、乙腈（色谱纯，山东禹王有限公司）；磷酸、盐酸、磷酸氢二钠（分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；四硼酸钠（天津博迪化工股份有限公司）；临苯二甲醛（OPA）、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC）、硼酸盐缓冲液（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；15种氨基酸对照品（批号624-200104）购自中国食品药品检定研究院。本实验收集土鳖虫样品共18批，由沈阳药科大学生药学教授贾英鉴定为土鳖虫Eupolyphaga Steleophaga及其混淆品金边地鳖雌虫干燥体。药材信息见表 1。药材经粉碎后，过60目筛，置于干燥阴凉处保存备用。

表 1(Table 1)

表 1 18批药材来源 Table 1 Sources of 18 samples 批次 名称 产地 1 地鳖 山东临沂 2 地鳖 江苏常州 3 金边地鳖 广西南宁 4 冀地鳖 河北安国 5 金边地鳖 海南澄迈 6 地鳖 江苏常州 7 地鳖 安徽亳州 8 地鳖 安徽亳州 9 地鳖 江苏常州 10 冀地鳖 北京 11 地鳖 浙江苏州 12 地鳖 河南南阳 13 金边地鳖 河南洛阳 14 冀地鳖 河南洛阳 15 金边地鳖 广西钦州 16 地鳖 江苏淮安 17 地鳖 浙江杭州 18 地鳖 上海

表 1 18批药材来源 Table 1 Sources of 18 samples

色谱柱：Durashell-AA（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相组成为A：0.01 mol/L磷酸氢二钠及的四硼酸钠水溶液（盐酸调节pH值至8.2）；流动相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10）；体积流量1.6 mL/min；检测波长：0～24 min，338 nm；24～27 min，228 nm；柱温45 ℃；进样量1 μL。梯度洗脱程序：0～6 min，5%～8% A；6～11 min，8%～13% A；11～19 min，13%～28% A；19～22 min，28%～36% A；22～27 min，36%～75% A。

稀盐酸（0.1 mol/L）：取36%盐酸4.16 mL，加水稀释至500 mL；衍生试剂（OPA）：取A试剂1支，加入B试剂60 μL，混匀；稀释剂：取100 mL流动相A，加磷酸0.5 mL，混匀。

取进样瓶6个，编号1～6，并依此加入硼酸缓冲液、水、OPA衍生剂、FMOC衍生剂、稀释剂、待测样品。设置自动衍生化程序为分别从1号瓶中吸取硼酸盐缓冲液5 μL，从6号瓶中吸取样品1 μL，在空气中以最大速度混合6次。等待0.5 min，从2号瓶中吸取水10 μL，从3号瓶中吸取OPA衍生剂1 μL，在空气中以最大的速度混合6次。从2号瓶中吸取水10 μL，从4号瓶中吸取FMOC衍生剂1 μL，在空气中以最大的速度混合10次。从5号瓶中吸取稀释剂32 μL，在空气中以最大的速度混合8次后进样。

取药材粉末5.0 g，置于锥形瓶中，加入乙醇-水（50∶50）25 mL，混匀，超声提取30 min，涡旋5 min，10 000 r/min离心机离心2次，每次3 min。取上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

分别精密称取15种氨基酸对照品适量，加入浓度为0.1 mol/L稀盐酸溶解并摇匀，制得浓度分别为丝氨酸0.21 mol/L、组氨酸0.52 mol/L、甘氨酸0.37 mol/L、苏氨酸0.18 mol/L、精氨酸0.685 mol/L、丙氨酸1.52 mol/L、酪氨酸0.27 mol/L、缬氨酸0.46 mol/L、色氨酸0.18 mol/L、异亮氨酸0.61 mol/L、苯丙氨酸0.28 mol/L、赖氨酸0.45 mol/L、亮氨酸0.49 mol/L、脯氨酸0.83 mol/L、天冬氨酸0.76 mg/mL的混合对照品溶液。

取第15批药材供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下重复进样6次，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰相对于内参比峰（13号峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于1.7%。表明仪器的精密度良好。

取第15批药材6份，精密称定。按“2.3”条件制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰相对于内参比峰（13号峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.9%，相对峰面积的RSD均小于3.7%。表明方法的重复性良好。

取第15批药材供试品溶液，室温下分别在0、2、4、6、8、12 h进样分析，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰相对于内参比峰（13号峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.6%，相对峰面积的RSD均小于4.4%。表明供试品溶液室温下12 h内稳定。

HPLC指纹图谱共标定28个共有峰。以对照品对照，指认了15种氨基酸。标准指纹图谱见图 1。

图 1 土鳖虫标准指纹图谱 Fig.1 Standard fingerprint of E. steleophaga

将18批药材HPLC指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2009版）进行处理，获得土鳖虫及其混淆品的标准指纹图谱，以此为基准，计算样品共有色谱峰与共有模式的相似度，对18批供试品进行评价，其相似度见表 2，指纹图谱相似性比对见图 2。相似度分析结果显示，第3、5、13、15批相似度为0.909～0.923，较其他各批次低；其余各批次的相似度均高于0.941。其中，相似度略低的4批均属于金边地鳖。根据各色谱峰之间响应值高低可判断，缬氨酸在各批次中质量分数差别较大，相差约11倍，其余各氨基酸在不同批次中质量分数差别约为5～8倍。第2、6、11、17批次中，各氨基酸响应值整体较其他批次略高。

表 2(Table 2)

表 2 18批药材相似度结果 Table 2 Results of similarity of 18 batches of samples 批次 相似度 批次 相似度 1 0.970 10 0.948 2 0.969 11 0.974 3 0.913 12 0.963 4 0.941 13 0.911 5 0.906 14 0.944 6 0.966 15 0.902 7 0.965 16 0.950 8 0.949 17 0.968 9 0.967 18 0.943

表 2 18批药材相似度结果 Table 2 Results of similarity of 18 batches of samples

图 2 土鳖虫及其混淆品HPLC指纹图谱 Fig.2 HPLC fingerprint of E. steleophaga and its adulterants

实验中应用SPSS软件，以组间平均联接法聚类（between-group），利用欧式距离平方（squared euclidean distance）作为样品相似度的测度^[9]。18批药材可分为2类，样品1、2、4、6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18号为第I类，样品3、5、13、15号为第II类。第I类药材均为地鳖或冀地鳖，其中第4、10、14批为冀地鳖，其余批次为地鳖；第II类均为金边地鳖。通过聚类分析结果（图 3）显示，不同批次的药材主要按照不同属来聚类区分，与产地关系较小。说明土鳖虫主要成分及量受遗传及进化影响大于其受土壤、水分、温度等生长环境差别。地鳖、冀地鳖为《中国药典》2015年版中收录的土鳖虫药材，聚类分析结果显示，地鳖、冀地鳖的质量相近；金边地鳖尚未被《中国药典》2015年版收录，且通过其氨基酸指纹图谱相似度及系统聚类分析结果显示，金边地鳖与其他2类药材相比，相似度较低，进一步证实金边地鳖为土鳖虫混淆品。因此，建议禁止金边地鳖作为土鳖虫入药。

图 3 18批药材系统聚类分析结果 Fig.3 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 18 batches of samples

采用二极管阵列检测器考察了190～370 nm不同检测波长处的色谱图，结果表明一级氨基酸和二级氨基酸分别在在338 nm和228 nm处有最大吸收，因此采用切换波长法进行检测：0～24 min，338 nm；24～27 min，228 nm。

实验中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇乙腈-加盐水溶液等多种流动相系统，结果表明采用流动相组成为A：0.01 mol/L磷酸氢二钠及0.01 mol/L的四硼酸钠水溶液，盐酸调节pH值至8.2；流动相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10）时，各色谱峰分离度较好。

实验中考察了普通C₁₈色谱柱与Venusil AA氨基酸分析专用柱。Venusil AA氨基酸分析专用柱基线平稳，色谱峰数目较多，分离度和峰形较好，因此选用Venusil AA氨基酸分析专用柱进行指纹图谱研究。

本实验采用在线衍生化方法，在巯基试剂N-乙酰半胱氨酸存在下，一级氨基酸首先与OPA反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚一级氨基酸产物^[7]，而二级氨基酸不和OPA反应，然后再用FMOC与二级氨基酸反应生成FMOC-二级氨基酸衍生物^[10]。相比于传统柱前衍生化更加简便、快捷、误差小。使用OPA和FMOC作为衍生剂，样品制备简单、衍生化反应迅速、分析时间短、灵敏度高。本实验采用非挥发性的巯基试剂N-乙酰半胱氨酸，与常用的3-巯基丙酸（MPA）相比，具有无毒、无臭等优点。