岛津高效液相色谱仪，日本岛津公司；XP6电子天平、BP211D型电子分析天平，Mettler Toledo。

对照品没食子酸（批号110831-200803，质量分数90.1%）、5-羟甲基糠醛（5-HMF，批号110626-201308，质量分数＞98%）、马钱苷（批号110640-201005，质量分数99.2%）、芍药苷（批号110736-201136，质量分数94.9%）、丹皮酚（批号110708-200506，质量分数＞98%）、熊果酸（批号110742-201220，质量分数为99.3%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。莫诺苷系由军事医学科学院从山茱萸药材中分离所得，经¹H-NMR、¹³C-NMR结构鉴定，HPLC峰面积归一化法分析测得质量分数为95.7%。乙腈，色谱纯；水为自制纯化水；其余试剂均为分析纯。本实验所采用的熟地黄Rehmanniae Radix Praeparata（玄参科地黄属植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块根的炮制加工品）、山茱萸Corni Fructus（山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉）、牡丹皮Moutan Cortex（毛莨科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的干燥根皮）、茯苓［多孔菌科茯苓属植物真菌茯苓Poria cocos (Schw) Wolf的干燥菌核］、泽泻［泽泻科泽泻属植物泽泻Alisma orientalis (Sam) Juzep. 的块茎］和山药（薯蓣科薯蓣属植物薯蓣Dioscorea opposite Thunb. 的干燥根茎）6味药材购自连云港康济大药房，经江苏康缘药业股份有限公司吴舟执业药师鉴定均为正品。

表 1(Table 1)

表 1 六味地黄浓缩丸的编号、生产厂家及批号 Table 1 Code number,manufacturers,and batch numbers of Liuwei Dihuang Concentrated Pills 编号 生产厂家 批号 编号 生产厂家 批号 1 河南宛西制药股份有限公司 130920 11 黑龙江葵花药业股份有限公司 20120307 2 吉林金宝药业股份有限公司 141002 12 哈药集团世一堂制药厂 1308704 3 北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂 12072083 13 东芝堂药业（安徽）有限公司 140301 4 湖北炎黄本草药业有限公司 20130101 14 吉林济邦药业有限公司 20121102 5 安徽华佗国药股份有限公司 20130910 15 江西药都樟树制药有限公司 130409 6 九芝堂股份有限公司 201305021 16 上海宝龙安庆药业有限公司 140310 7 芜湖张恒春药业有限公司 1404081 17 陕西天洋制药有限责任公司 20140329 8 兰州佛慈制药股份有限公司 13E160 18 江苏颐海药业有限责任公司 140101 9 通药制药集团股份有限公司 140313 19 湖北隆中药业集团有限公司 140404 10 雷允上药业有限公司 MB9006 20 神威药业集团有限公司 140313

表 1 六味地黄浓缩丸的编号、生产厂家及批号 Table 1 Code number,manufacturers,and batch numbers of Liuwei Dihuang Concentrated Pills

色谱柱为Agilent TC-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，4%乙腈；5～30 min，4%～16%乙腈；30～40 min，16%乙腈；40～55 min，16%～92%乙腈；55～70 min，92%～95%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长：0～60 min，238 nm；60～70 min，210 nm。色谱图见图 1。

1-gallic acid 2-5-HMF 3-morroniside 4-loganin 5-paeoniflorin 6-paeonol 7-ursolic acid > 图 1 混合对照品 (A)，六味地黄浓缩丸样品 (B) 及缺牡丹皮 (C)、缺山茱萸 (D)、缺熟地黄 (E)、缺熟地黄＋山茱萸 (F) 和缺熟地黄＋山茱萸＋牡丹皮 (G) 阴性样品的HPLC图Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A),Liuwei Dihuang Concentrated Pills sample (B),negative sample without Moutan Cortex (C),without Corni Fructus (D),without Rehmanniae Radix Praeparata (E),without Rehmanniae Radix Praeparata + Corni Fructus (F),and Rehmanniae Radix Praeparata + Corni Fructus + Moutan Cortex (G)

分别精密称取没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇分别制成含没食子酸37.8 μg/mL、5-HMF 188.5 μg/mL、莫诺苷21.2 μg/mL、马钱苷34.6 μg/mL、芍药苷22.9 μg/mL、丹皮酚39.9 μg/mL、熊果酸24.5 μg/mL的混合对照品溶液。

取质量差异下的六味地黄浓缩丸样品，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，水浴回流（70 ℃）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

按处方比例分别称取除熟地黄，除山茱萸（制），除牡丹皮，除熟地黄和山茱萸（制），除牡丹皮、山茱萸（制）、熟地黄以外的其余药味，按六味地黄浓缩丸制备工艺分别制备缺熟地黄，缺山茱萸（制），缺牡丹皮，缺熟地黄及山茱萸，缺熟地黄、山茱萸（制）、牡丹皮阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

精密吸取对照品溶液10 μL，按“2.1”色谱条件，进样，测定，连续6次。以没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸的峰面积计算，其RSD分别为0.40%、0.33%、0.33%、0.33%、0.86%、0.34%、0.34%，结果表明，仪器精密度良好。

取没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成所需浓度的对照品溶液，即得。分别吸取上述溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积平均值为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程、相关系数（r）和线性范围，分别为没食子酸：Y＝10 160 895 X－5 687.5，r＝0.999 8，线性范围3.8～75.6 μg/mL；5-HMF：Y＝12 986 231 X－26 220，r＝0.999 7，线性范围18.845～376.9 μg/mL；莫诺苷：Y＝19 711 638 X－6 364.9，r＝0.999 8，线性范围2.12～42.4 μg/mL；马钱苷：Y＝18 918 031 X－9 313.8，r＝0.999 8，线性范围3.46～69.2 μg/mL；芍药苷：Y＝16 380 034 X－8 502，r＝0.999 7，线性范围2.29～45.8 μg/mL；丹皮酚：Y＝25 552 672 X－7 906.1，r＝0.999 7，线性范围3.99～79.8 μg/mL；熊果酸：Y＝54 664 962 X－1 788.3，r＝0.999 8，线性范围2.45～49.0 μg/mL。结果表明，没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸在各自的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取“2.3”项供试品溶液，分别于制备后0、2、6、8、10、12、24 h分别进样，按“2.1”项色谱条件测定，以没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸峰面积计算，结果RSD值分别为0.85%、1.42%、1.63%、1.31%、1.47%、0.63%、1.06%，结果表明供试品溶液放置24 h稳定。

按“2.3”项下的方法，制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸平均质量分数分别为1.92、6.82、0.82、1.72、0.89、1.99、0.12 mg/g，RSD值分别为1.05%、1.49%、1.47%、0.85%、1.57%、1.48%、0.81%，RSD值均小于2%，表明该方法重复性良好。

精密称取已测定的样品（样品1，研细）粉末0.25 g，共6份，精密加入没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定7个指标性成分的量，计算回收率。结果没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸的平均回收率分别为97.68%（RSD 1.74%）、100.82%（RSD 1.69%）、98.74%（RSD 1.03%）、100.70%（RSD 1.53%）、98.61%（RSD 1.94%）、100.33%（RSD 1.19%）、100.66%（RSD 2.15）。结果显示，准确性较好。

2.10 样品的测定

取不同厂家六味地黄丸，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，每次进样量10 μL。取“2.2”项下的对照品溶液，进样10 μL。按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算7种成分的量，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 六味地黄浓缩丸中7种成分测定结果 Table 2 Determination of seven major components in Liuwei Dihuang Concentrated Pills 编号 质量分数/( mg∙g-1) 没食子酸 5-HMF 莫诺苷 马钱苷 芍药苷 丹皮酚 熊果酸 1 1.89 7.75 0.95 1.77 0.88 2.11 0.12 2 3.40 5.68 0.94 2.06 1.05 2.61 0.20 3 2.48 3.88 1.64 2.13 0.72 2.34 0.19 4 0.56 0.08 1.73 1.47 0.30 2.41 0.17 5 1.52 2.90 1.11 1.80 0.33 2.83 0.16 6 1.20 1.63 1.55 1.85 0.25 2.83 0.15 7 0.88 5.28 0.79 1.82 0.15 1.73 0.21 8 1.25 1.11 1.50 1.81 0.30 2.13 0.12 9 0.35 2.41 1.82 2.52 0.08 2.46 0.13 10 1.62 3.88 0.59 1.65 0.70 3.40 0.16 11 1.81 0.88 1.72 1.76 1.38 2.01 0.13 12 1.71 2.38 1.16 1.71 1.04 2.71 0.15 13 0.88 3.57 0.71 1.60 0.32 2.10 0.13 14 0.68 0.52 1.86 1.83 0.10 2.12 0.15 15 1.05 4.84 0.64 1.71 0.27 2.58 0.14 16 0.47 1.82 1.24 1.77 0.05 1.96 0.14 17 1.16 3.62 0.76 1.65 0.15 1.93 0.14 18 0.96 5.39 1.64 2.26 0.00 2.45 0.12 19 1.19 4.31 1.58 2.35 0.51 2.47 0.14 20 1.82 2.40 0.84 1.85 0.56 2.71 0.14

表 2 六味地黄浓缩丸中7种成分测定结果 Table 2 Determination of seven major components in Liuwei Dihuang Concentrated Pills

应用SPSS 18.0软件，采用组间均联法（between-groups Linkage），选用夹角余弦（cosine）作为刻度，将上述20个测试样品进行聚类分析，结果见图 2。通过聚类分析，根据各样品之间的距离差异将该20个不同厂家的样品分为2类，其中，编号4、6、8、9、11、14和16的厂家样品被归为一类，质量差异相对较小；其余厂家产品被归为一类，产品之间7种成分的量差异不大。该树状图能够直观地反映不同厂家生产的六味地黄浓缩丸中检测成 分之间所存在的差异。

图 2 20个厂家的六味地黄浓缩丸聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis on of Liuwei Dihuang Concentrated Pills from 20 manufacturers

本实验比较了乙腈-0.1%甲酸^[8]、乙腈-0.015%磷酸水溶液^[9]和乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液3种流动相系统，结果采用乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液待测成分分离效果最佳，且梯度洗脱才能检出所测成分。应用二极管阵列检测器在210～400 nm扫描，结果选取238 nm作为检测波长，能检测除熊果酸以外其他成分，鉴于熊果酸为末端吸收（210 nm），本实验采用切换波长法同时测定样品中7种成分的量。结果表明此方法切实可行，可以用于同时测定样品中的指定成分的量。

本实验建立了一种简便、快捷测定六味地黄浓缩丸中没食子酸、5-HMF、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚、熊果酸7种成分的定量分析方法。并通过聚类分析法，以7种成分的量为指标，对20个厂家的样品进行分类，图谱结果佐证了不同厂家产品各成分量之间存在差异，其中芍药苷差别最大，这可能与投料药材或者工艺过程有关。中药通常以复方形式存在，呈现出多成分、多靶点、多通路调控机体的特点，由此达到治疗疾病的目的^[10]，因此，中药质量控制需要同时控制多个成分的量，从而使中药疗效更稳定。

综上所述，不同厂家生产的同一品种仅依靠2个指标来评价，不足以反映中药多组分、多靶点的特性，应尽可能多地对其药效成分进行研究^{[4, 11, 12, 13]}，

但是分别检测多个成分费时、费力，同时测定多种成分量的方法可以实现中药材及其制剂的有效质量控制，亦可以减少资源的浪费。通过对比定量测定结果，可以发现各厂家马钱苷和丹皮酚的量均符合《中国药典》2010年版规定^[6]，且其量差别较小；但其他成分（芍药苷、5-HMF、没食子酸和莫诺苷）差别较大，因此建议完善企业内部质量控制标准，同时对原料来源和工艺过程严格把关，以保证该产品的疗效。本研究从多成分测定的角度出发，通过切换波长法，建立了一种可以同时测定浓缩丸中7种成分量的方法，为六味地黄浓缩丸质量评价的提升提供一定的参考依据。