葛根为豆科（Leguminosae）植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根，是《中国药典》2010年版收录的常用中药之一，其性凉，味甘、辛，归脾、胃、肺经，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒之功效。临床上多用于外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛、酒毒伤中等症^[1]。枳椇子为鼠李科（Rhamnaceae）拐枣属Hovenia Thunb. 植物枳椇Hovenia acerba Lindl. 的干燥成熟种子，属养阴、生津、润燥、止渴、凉血类药物。其主要为清热利尿、止渴除烦、解酒毒，用于热病烦渴、呃逆、小便不利^[2]。葛根枳椇软胶囊是以葛根提取物与枳椇子提取物为主要原料，经国家食品药品监督管理局批准的保健食品，对化学性肝损伤有辅助保护功能。目前，采用HPLC-MS方法对葛根成分的定性与定量的相关研究已有不少报道^{[3, 4, 5]}，耗时多为1 h以上；枳椇子成分的相关研究^{[6, 7]}较少，未见对葛根枳椇软胶囊制剂的相关报道。以天然植物为原料开发的保健食品，每一味中药都是一个复杂体系，包含着丰富的化学成分。而这类保健食品以测定总黄酮、粗多糖、总皂苷等或只测定1～2个化学成分的量作为质量控制指标^[8]，针对性不强，测定结果不稳定。

本实验拟采用UPLC/Q-TOF-MS技术建立同时测定葛根枳椇软胶囊中多种黄酮类功效成分的快速分析方法，为阐明其功效物质基础及质量控制提供一定的研究思路和方法。

Agilent 1290型液相色谱仪（在线脱气机，二元泵，高性能自动进样器和DAD检测器）；Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS质谱仪（MassHunter workstation Data Acquisition工作站和MassHunter Qualitative Analysis software质谱分析软件）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mettler XS205DU电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；MilliPore Advantage A10自动纯水机（美国默克密理博公司）。

芦丁（批号0080-9504）、葛根素（批号110752- 200912）、大豆苷（批号111738-201302）、染料木苷（批号111709-200501）、大豆苷元（批号100502- 200402）、鹰嘴豆芽素A（批号111708-200501）、槲皮素（批号10081-200907）、异鼠李素（批号110860- 200406）对照品均购于中国食品药品检定研究院；芒柄花苷（批号486-62-4，质量分数≥98%，购于成都瑞芬思生物科技有限公司）；3′-甲氧基葛根素（批号117047-07-1，质量分数≥98%，购于上海纯优生物）；鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷（批号117047- 1205，质量分数≥98%，购于上海古朵生物科技有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯试剂（默克），水为超纯水；葛根枳椇软胶囊（总黄酮5.10 mg/g；批号14010201）购于威海紫光生物科技开发有限公司。

色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C₁₈（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～2 min，10%～15% A；2～3 min，15%～17% A；3～5 min，17%～27% A；5～6 min，27%～35% A；6～8 min，35% A。柱温25 ℃；体积流量0.4 mL/min；进样体积1 μL；紫外检测波长254 nm。

电喷雾负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1 000；离子源参数：干燥气温度300 ℃，干燥气体积流量10 L/min，雾化气压力276 kPa，鞘流气温度350 ℃，鞘流气流量11 L/min，毛细管电压3 500 V，碎片电压175 V，碰撞电压15～40 V，离子能量1 eV，每0.2秒采集1次图谱；选择参比校准液甲酸盐加合物（商品名HP0921，相对分子质量966，C₁₉H₁₉O₈N₃P₃F₂₄）作实时质量数校正。

取10粒软胶囊的内容物，搅拌均匀，取内容物0.5 g，加25 mL甲醇，超声30 min，冷却，冰箱保持冷却2 h，待油脂类物质析出后，定性滤纸趁冷滤过，滤液再过微孔滤膜（0.22 μm），作为供试品溶液。

取芦丁、葛根素、大豆苷、染料木苷、芒柄花苷、大豆苷元、鹰嘴豆芽素A、槲皮素、异鼠李素、3′-甲氧基葛根素、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成含芦丁51.0μg/mL、葛根素48.6 μg/mL、大豆苷40.4 μg/mL、染料木苷41.2 μg/mL、芒柄花苷51.3 μg/mL、大豆苷元10.4 μg/mL、鹰嘴豆芽素A 36.4 μg/mL、槲皮素30.1 μg/mL、异鼠李素20.4 μg/mL、3′-甲氧基葛根素45.2 μg/mL、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷39.7 μg/mL的溶液，过0.22 μm微孔滤膜，即得，备用。

葛根枳椇软胶囊中的黄酮类化合物极性较大且热不稳定，分子中的羟基容易形成稳定的氧负离子，使用ESI离子源，负离子模式检测所得总离子流图（图 1）有较好的信噪比，且与254 nm波长下紫外检测色谱图基本吻合。通过对色谱峰进行二级质谱研究，20个化合物的准确相对分子质量和离子碎片信息数据见表 1。

对总离子流图中主要的20个色谱峰进行鉴别。首先，根据TOF-MS上所得到的精确化合物相对分子质量信息，通过MassHunter Qualitative Analysis

图 1 葛根枳椇软胶囊提取液的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of extract from Gegen Zhiju Soft Capsule

Software质谱分析软件在质量偏差为5的范围内计算其可能的元素组成，将可能的元素组成与高分辨相对分子质量输入Agilent MassHunter Molecular Structure Correlator数据库中查找有关的化学成分结构，与文献报道^{[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]}的化学成分进行比对，结合保留时间及裂解碎片信息进行综合分析，初步推断葛根枳椇软胶囊提取液中的黄酮类成分的结构。

峰1：葛根素-4′-O-β-D-葡萄糖苷。通过该峰的相

表 1(Table 1)

表 1 葛根枳椇软胶囊提取物中黄酮类化合物的UPLC-PDA-TOF/MS分析 Table 1 Analysis on flavonoids in extract from Gegen Zhiju Soft Capsule by UPLC-Q-TOF-MS/MS 峰号 tR/min 化合物名称 分子式 负离子模式 (m/z) MS/MS碎片离子信息 测量值 理论值 偏差 1 1.371 葛根素-4′-O-β-D-葡萄糖苷 C27H30O14 577.156 2 [M－H]- 577.155 2 -1.77 457 2 1.761 大豆素-4′,7-O-葡萄糖苷 C27H30O14 623.161 8 [M＋HCOO－H]- 623.160 7 -1.83 415 3 1.935 3′-氢化葛根素 C21H20O10 431.098 9 [M－H]- 431.097 3 -3.78 283,311 4 2.251 3′-氢化葛根素木糖苷 C26H28O14 563.140 6 [M－H]- 563.139 5 -1.90 283,311 5 2.683 葛根素 C21H20O9 415.103 5 [M－H]- 415.102 4 -2.76 267,295 6 2.890 3′-甲氧基葛根素 C22H22O10 445.115 1 [M－H]- 445.112 9 -4.90 325,310,297,282 7 2.940 葛根素-7-木糖苷 C26H28O13 547.146 8 [M－H]- 547.144 6 -4.00 295,267 8 3.114 3′-甲氧基葛根素木糖苷 C27H30O14 577.155 8 [M－H]- 577.155 2 -1.07 325,310,297,282 9 3.584 大豆苷 C21H20O9 461.109 1 [M＋HCOO－H]- 461.107 8 -2.74 415,253 10 3.895 3′-甲氧基大豆苷 C22H22O10 491.119 4 [M＋HCOO－H]- 491.118 4 -2.04 445,283 11 4.069 染料木素-8-C-芹菜葡萄糖苷 C26H28O1 563.140 2 [M－H]- 563.139 5 -1.19 283,311 12 4.567 芦丁 C27H28O16 609.148 0 [M－H]- 609.145 0 -4.91 301,300 13 4.907 染料木苷 C21H20O10 477.103 6 [M＋HCOO－H]- 477.102 8 -1.78 431,269 14 5.115 鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷 C27H30O15 593.152 0 [M－H]- 593.150 1 -3.21 284 15 5.204 6-羟基鹰嘴豆芽素A-6,7-二葡萄糖苷 C28H30O16 623.163 2 [M－H]- 623.160 7 -4.08 315,314 16 6.061 芒柄花苷 C22H22O9 475.124 8 [M＋HCOO－H]- 475.123 5 -2.77 267 17 6.402 大豆苷元 C15H10O4 253.050 8 [M－H]- 253.049 5 -5.02 223,208,195,133,132 18 6.543 鹰嘴豆芽素A C16H12O5 283.061 7 [M－H]- 283.060 1 -4.96 268 19 6.579 槲皮素 C15H8O7 301.034 8 [M－H]- 301.034 3 -1.66 178,151,121,107 20 7.846 异鼠李素 C16H12O7 315.050 6 [M－H]- 315.049 9 -2.22 300,151,107

表 1 葛根枳椇软胶囊提取物中黄酮类化合物的UPLC-PDA-TOF/MS分析 Table 1 Analysis on flavonoids in extract from Gegen Zhiju Soft Capsule by UPLC-Q-TOF-MS/MS

对分子质量理论值为577.155 2，实测值为577.156 2，可推断其分子式为C₂₇H₃₀O₁₄，以m/z 577.156 2为母离子，进行二级质谱分析，所得二级质谱图中有明显的457 [M－H－C₄H₈O₄]^- 碎片离子信息，是其母分子离子失去C₄H₈O₄（Mv 120）分子产生的，推测其裂解途径见图 2。

峰2：大豆素-4′,7-O-葡萄糖苷。质谱给出分子离子峰m/z 623.161 8 [M＋HCOO－H]^-，推断其分子式为C₂₇H₃₀O₁₄，以m/z 623.161 8为母离子进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的415 [M－H－Glc]^- 碎片离子信息，推测是其母分子离子失去葡萄糖分子（Mv 162）产生的。

图 2 葛根素-4′-O-β-D-葡萄糖苷可能的裂解途径Fig.2 Possible fragmentation meehanism of puerain-4′-O-β-D-glucoside

峰3：3′-氢化葛根素。质谱给出分子离子峰m/z 431.098 9 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₁H₂₀O₁₀，以m/z 431.098 9作为母离子进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的311、283碎片离子信息，311 [M－H－120]^-为糖环的交叉环切除裂解，丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，283 [M－H－120－28]^- 是继而丢失1个CO分子形成的碎片离子。

峰4：3′-氢化葛根素木糖苷。质谱给出分子离子峰m/z 563.140 6 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₆H₂₈O₁₄，以m/z 563.140 6作为母离子进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的311、283碎片离子信息，311 [M－H－Xyl－120]^-为其母分子离子失去木糖分子（Mv 132），再丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，283 [M－H－Xyl－120－28]^- 是继而丢失1个CO分子形成的碎片离子。

峰5：葛根素。质谱给出分子离子峰415.103 5 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₁H₂₀O₉，以m/z 415.103 5为母离子进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的295、267碎片离子信息，295 [M－H－120]^－为糖环的交叉环切除裂解，丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，267 [M－H－120－28]^－是继而丢失1个CO分子形成的碎片离子，裂解途径同峰3。

峰6：3′-甲氧基葛根素。质谱给出分子离子峰m/z 445.115 1 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₂H₂₂O₁₀，以m/z 445.115 1作为母离子进行二级质谱分析，所得二级质谱图中有明显的325、310、297、282碎片离子信息。325 [M－H－120]^- 为糖环的交叉环切除裂解，丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，310 [M－H－120－15]^- 是继而丢失1个CH₃分子形成的碎片离子，297 [M－H－120－28]^- 是继325碎片丢失1个CO分子形成的碎片离子，282 [M－H－163]^-是其母离子失去葡萄糖分子产生的碎片离子。推测其裂解途径见图 3。

峰7：葛根素-7-木糖苷。质谱给出分子离子峰547.146 8 [M－H]^-，可推断其元素组成为C₂₆H₂₈O₁₃，以m/z 547.146 8为母离子，进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的295、267碎片离子信息。295 [M－H－Xyl－120]^-为其母分子离子失去木糖分子（Mv 132），再丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，267 [M－H－Xyl－120－28]^- 是其继而丢失1个CO分子形成的碎片离子。

图 3 3′-甲氧基葛根素可能的裂解途径Fig.3 Possible fragmentation mechanism of 3′-methoxy- puerarin

峰8：3′-甲氧基葛根素木糖苷。质谱给出分子离子峰m/z 577.155 8 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₇H₃₀O₁₄，以m/z 577.155 8作为母离子进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的325、310、297、282碎片离子信息。325 [M－H－Xyl－120]^- 为其母分子离子失去木糖分子（Mv 132），继而丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，310 [M－H－Xyl－120－15]^- 是继而丢失1个CH₃分子形成的碎片离子，297 [M－H－Xyl－120－28]^- 是继325碎片丢失1个CO分子形成的碎片离子，282 [M－H－Xyl－Glc]^- 是其母分子离子失去木糖和葡萄糖分子产生的碎片离子。

峰9：大豆苷。质谱给出分子离子峰461.109 1 [M＋HCOO－H]^-，推断其分子式为C₂₁H₂₀O₉，以m/z 461.109 1作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得二级质谱图中有明显的253 [M－H－Glc]^- 碎片离子信息，是其母分子离子失去葡萄糖分子（Mv 162）产生的。

峰10：3′-甲氧基大豆苷。质谱给出分子离子峰491.119 4 [M＋HCOO－H]^-，推断其分子式为C₂₂H₂₂O₁₀，以m/z 491.119 4为母离子，进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的283 [M－H－Glc]^- 碎片离子信息，是其母分子离子失去葡萄糖分子（Mv 162）产生的。

峰11：染料木素-8-C-芹菜葡萄糖苷。质谱给出分子离子峰563.140 2 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₆H₂₈O₁₄，以m/z 563.140 2作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的311、283碎片离子信息。311 [M－H－Api－120]^- 为其母分子离子失去芹糖分子（Mv 132）分子，接而丢失C₄H₈O₄（Mv 120）分子形成的碎片离子，283 [M－H－Api－120－28]^-是其继而丢失1个CO分子形成的碎片离子。

峰12：芦丁。质谱给出分子离子峰609.148 0 [M－H]^-，可推断其分子式为C₂₇H₂₈O₁₆，以m/z 609.148 0作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的300、301 [M－H－Rha－Glc]^-碎片离子信息，是其母分子离子依次失去鼠李糖（Mv 146）和葡萄糖分子（Mv 162）分子产生的。

峰13：染料木苷。质谱给出分子离子峰477.103 6 [M＋HCOO－H]^-，推断其分子式为C₂₁H₂₀O₁₀，以m/z 477.103 6作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的269 [M－H－Glc]^- 碎片离子信息，是其母分子离子失去葡萄糖分子（Mv 162）分子产生的。

峰14：鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷。质谱给出分子离子峰593.152 0 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₇H₃₀O₁₅，以m/z 593.152 0作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的284 [M－H－Xyl－Glc－15]^- 碎片离子信息，是其母分子离子失去木糖分子（Mv 132）和葡萄糖分子（Mv 162）后继而丢失1个CH₃分子形成的碎片离子。

峰15：6-羟基鹰嘴豆芽素A-6,7-二葡萄糖苷。质谱中给出分子离子峰623.163 2 [M－H]^-，推断其分子式为C₂₈H₃₀O₁₆，以m/z 623.163 2作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得二级质谱图中有明显的314、315碎片离子信息，315 [M－H－120－120－C₃O₂]^-为糖环的交叉环切除裂解和丢失1个C₃O₂分子形成的碎片离子。推测其裂解途径见图 4。

图 4 6-羟基鹰嘴豆芽素A-6,7-二葡萄糖苷可能的裂解途径Fig.4 Possible fragmentation mechanism of 6-hydroxy- biochanin A-6,7-di-O-glucoside

峰16：芒柄花苷。质谱给出分子离子峰475.124 8 [M＋HCOO－H]^-，推断其分子式为C₂₂H₂₂O₉，以m/z 475.124 8作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的267 [M－H－Glc]^-碎片离子信息，是其母分子离子失去葡萄糖分子（Mv 162）产生的。

峰17：大豆苷元。质谱给出分子离子峰253.050 8[M－H]^-，推断其分子式为C₁₅H₁₀O₄，以m/z 253.050 8作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的224、223、209、208、196、195、133、132碎片离子信息，224 [M－H－29]^- 是其丢失1个CHO分子形成的碎片离子，196 [M－H－29－28]^- 是继而丢失1个CO分子形成的碎片离子。209 [M－H－44]^-是母离子丢失1个CO₂分子形成的碎片离子，133是母离子C环上发生RDA裂解形成的^0,3B^-碎片离子。推测其裂解途径见图 5。

峰18：鹰嘴豆芽素A。质谱给出分子离子峰283.061 7[M－H]^-，推断其分子式为C₁₆H₁₂O₅，以m/z 283.061 7作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的268 [M－H－15]^-碎片离子信息，是其丢失1个CH₃分子产生的。

峰19：槲皮素。质谱给出分子离子峰301.034 7 [M－H]^-，推断其分子式为C₁₅H₈O₇，以m/z 301.034 8作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的179、151、121、107碎片离子信息。C环1/2位上C-C键断裂，得碎片^1,2A-(m/z 179) 和^1,2B^-(m/z 121)，m/z 151和m/z 107特征离子产生的断裂途径为RDA反应，裂解途径见图 6。

峰20：异鼠李素。质谱给出分子离子峰m/z 315.051 0 [M－H]^-，推断其分子式为C₁₆H₁₂O₇，以m/z 315.051 0作为母离子，对其进行二级质谱分析，所得谱图中有明显的300、151、107碎片离子信息。m/z 300 [M－H]^-为丢失1个CH₃分子产生的，m/z 151和m/z 107特征离子产生的断裂途径为RDA反应。

图 5 大豆苷元可能的裂解途径 Fig.5 Possible fragmentation mechanism of daidzein

图 6 槲皮素可能的裂解途径 Fig.6 Possible fragmentation mechanism of quercetin

UPLC/Q-TOF-MS分析具有高分离度、高速度、高灵敏度、可测定精确相对分子质量等特点^{[16, 17, 18]}，尤其适用于中药多组分、复杂成分的分离和定性鉴别。本实验运用UPLC-MS技术可以在8 min内完成化合物的分离，将其用于成分鉴定和指认，避免了采用对照品核对成分峰的局限性，体现了Q-TOF在化合物鉴定工作中的优势，为葛根枳椇胶囊的化学物质基础研究提供了更为快速有效的手段。

乙腈洗脱能力较甲醇强，且溶剂黏度较低，故选择乙腈作为有机溶剂，达到了快速分离色谱峰的目的。考察了乙腈与水及不同种类的挥发性缓冲液（甲酸溶液、乙酸铵溶液）组成的流动相体系对化合物的色谱行为及离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-甲酸作为流动相可获得最优的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。黄酮易于失去1个质子，以 [M－H]^-的准分子离子峰形式存在，故选择负离子模式采集数据。

由于样品辅料中含有大豆油、明胶、甘油等，待有机溶剂提取完后，样品放置于保持低温（4 ℃）的进样器中容易析出油脂，如果直接进样易对色谱柱有一定的损坏，故样品提取完后，先置于冰箱待油脂析出后，趁冷过滤备用，进而减少杂质对仪器和色谱柱的影响。

本实验运用UPLC-Q-TOF-MS法对葛根枳椇软胶囊中的黄酮类成分进行了分离及结构鉴定。根据各个色谱峰在质谱中的精确相对分子质量、质谱碎片结构信息和色谱保留规律，参考相关文献，成功鉴定了葛根枳椇软胶囊中20个化合物，其中17个化合物为异黄酮，3个化合物为黄酮，并总结了黄酮化合物质谱裂解的途径。其中芦丁、葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、鹰嘴豆芽素A、槲皮素、异鼠李素、芒柄花苷、3′-甲氧基葛根素、鸢尾黄素-7-O-木糖葡萄糖苷与对照品对照后进行确认，其他成分则通过二级质谱扫描MS²，并根据特征碎片离子峰加以确认。本实验建立的快速筛查方法，为其质量控制提供了新的方法和途径。