中药对人类健康的贡献日益受到国际社会的关注，然而多数中药药效物质基础不清已成为制约中药发展的瓶颈。在“回归自然”浪潮及中医药产业化的大环境下，运用现代科技手段阐明中药的物质基础，是中药现代化的重要内容，也是提高中药疗效、稳定中药质量的重要手段。众所周知，中药化学成分复杂，除极少数矿物药以外，每一个单味中药所含的成分就相当于一个化合物库。这些众多类型的化合物并非均是活性分子。中药特定的药理活性往往与某些具有一定结构特征的分子群直接相关。中药活性成分筛选的目的是寻找中药中发挥治疗作用的化学成分群或明确中药药效的物质基础。近年来，随着现代生物技术、化学分离技术的发展，中药成分生物学活性评价及筛选研究日趋繁荣。本文系统总结了10年来该领域的研究进展，以及依托这些技术所获得的所有中药活性成分，以期能为中药新药研发提供资料及思路。

1 整体药效评估筛选法

神农尝百草是最原始的以人为试验对象的整体药效评估法，也是鉴定药物、食物与毒物，寻找中药资源最有效、最直接，当然也是最危险的方法。因而以动物（包括正常、疾病动物模型）进行药效评估的要求自然产生。动物层次药效评估能够从整体水平检测药物的疗效、毒副作用，其结果最接近人体试验。目前，利用疾病动物模型进行药效评估是中药新药研发过程中必不可少的环节，多种疾病的动物模型，如高血压、高脂血症、糖尿病等，也日趋成熟。

利用ip四氧嘧啶所致的糖尿病小鼠模型，金清等^[1]系统评估了木香Aucklandiae lappa Decne. 的乙醇提取物，乙醇提取物醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水提取部位降血糖效果；发现其中乙醇提取物醋酸乙酯部位降血糖活性较强；并对该部位用柱色谱法继续分离、精制，同时进行降血糖活性检测。最后筛选出了2种新的天然降血糖活性成分，木香烃内酯（costunolide）、去氢木香内酯（dehydrocostus lactone）。谭斌等^[2]利用大孔树脂吸附瓜蒌皮Trichosanthes kirilowii Maxim. 水煎液，然后分别用95%、70%、40%的乙醇及双蒸水洗脱，去除乙醇得到瓜蒌皮的4个提取物。采用舌下注射低密度脂蛋白（LDL）的方法制备大鼠血管内皮损伤模型。利用该模型评价上述4种提取物的血管保护活性，发现其中水、70%乙醇提取物对大鼠血管内皮损伤保护作用显著。高文义等^[3]以正常大鼠在给药前后血压变化情况，观察茺蔚子Leonuri Fructus醇提液的乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水萃取物的降血压活性；发现茺蔚子水溶性成分对正常大鼠降血压作用明显，水层中主要含生物碱类成分，因而生物碱可能是茺蔚子降血压作用的主要活性成分。

尽管利用动物模型进行新复方中药活性评价的研究资料不胜枚举，但通过该方法进行中药活性成分筛选的资料却很少。主要原因是需要的受试样品量大，而多种中药单体极难大量制备，不能满足实验要求；另外该方法实验周期长，工作量大，无法实现大规模、高通量筛选。因而，用于活性成分筛选的各种细胞模型应运而生。

2 细胞层次的活性评估法

细胞是生命最基本的结构与功能单位。对于一个完整而有活性的细胞来说，生存环境中各种因素的变化，均会引起其内部的代谢变化；因而能够为中药活性成分筛选提供一个最小而又相对完整的生物体系。同时使用培养的细胞筛选活性成分成本低、周期短，因此细胞药物筛选模型得到了迅速发展^[4]。2.1 抗肿瘤药物筛选细胞模型

目前各种癌细胞株不仅容易获得、易于培养，而且实验操作简单。因而，检测某中药成分是否可体外诱导肿瘤细胞坏死、凋亡或抑制增殖已经成为抗肿瘤中药活性成分筛选第一步。以这种方法配合动物体内抑瘤实验，已成功从中药中发现了众多抗肿瘤的候选药物^[4]。

常中飞等^[5]利用人肝癌HepG-2细胞株、大鼠胶质瘤C6细胞株为实验材料，MTT法检测魔芋Amorphophallus rivieri Durieu 的水提物、醇提物、醋酸乙酯萃取物及石油醚萃取物对肿瘤细胞的增殖抑制作用，发现其中醋酸乙酯萃取物及石油醚萃取物可显著抑制肿瘤细胞增殖。采用沉淀反应或颜色反应对这2种萃取物进行化学成分分析，结果显示其主要成分为有机酸、生物碱、黄酮类、挥发油、香豆素等。刘春宇等^[6]培养了人早幼粒白血病细胞、人肝癌细胞、人低分化胃肠癌细胞、人肺癌细胞和人宫颈癌细胞等多种细胞株，利用MTT法对沙苑子Astragali Complanatii Semen不同成分群体外抑制癌细胞增殖的效果进行评估，同时采用S₁₈₀小鼠肉瘤模型进行体内抑瘤效果检验，从而明确沙苑子总黄酮为其抗肿瘤的主要活性成分。

2.2 细胞保护的药物评价筛选模型

张子理等^[7]通过在培养液中添加党参Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. 系列提取物处理小肠隐窝细胞株（IEC-6），检测不同成分对细胞生存、增殖的作用效果，以及对该细胞分泌功能的影响，从而建立了胃肠黏膜损伤修复药物筛选的细胞模型，并筛选了党参中具有调节细胞增殖作用防治胃溃疡的活性成分。原江锋等^[8]体外建立人血管内皮细胞ECV304/大脑皮层细胞株C6细胞共培养系统，作为血脑屏障（BBB）药物筛选模型，从丹参Salvia miltiorrhiza Bge. 提取液中筛选可能作用于中枢神经系统的活性成分，并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析，发现丹参提取液中至少有16种成分能够透过BBB，其中4种成分为隐丹参酮（cryptotanshinone）、丹参酮I（tanshinone I）、丹参素（tanshinol）和原儿茶酸（protocatechuic acid）。

2.3 特定靶受体筛选的细胞模型

随着细胞信号转导理论不断丰富，学者们逐渐认识到某些关键受体是多种药物的作用靶点。因而从中药中筛选某种功能细胞内关键受体的激活剂或抑制剂成为中药药理学界的研究热点。这种方法的成功建立依赖于稳定表达特定关键受体的细胞。多种细胞稳定表达组织细胞特异性受体，这给受体激活或抑制剂筛选细胞模型的建立提供了方便。

巨噬细胞表达丰富的甘露糖受体（MR）。MR可与以甘露糖末端的配体结合。田维毅等^[9]利用这一特点，建立巨噬细胞甘露糖受体（MMR）结合物筛选模型。大致过程是体外培养小鼠腹腔巨噬细胞→将该细胞分别与不同浓度的D-甘露糖、D-半乳糖共同孵育→除去未结合D-甘露糖、D-半乳糖→细胞与异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白（M- FITC-BSA）共同孵育→流式细胞仪、荧光显微镜检测巨噬细胞与M-FITC-BSA的结合率，检测模型的有效性。通过优化各种实验条件，建立有效的MMR筛选模型；并用于筛选四物汤等6个复方多糖中的MR结合成分。结果发现在一定浓度下，四君子汤、六味地黄汤和玉屏风散多糖组分能明显拮抗巨噬细胞与M-FITC-BSA的结合。因而，这3种复方多糖可能通过与MR结合发挥药理活性。

另一种方法是通过基因转染的方法，使特定细胞株内稳定、大量表达某种特异性受体，从而得到建立模型所需要的细胞株。这种方法有很多成功的例子。为筛选能激活D5受体的天然活性成分，邓小红等^[10]以人多巴胺受体D5R基因转染人胚肾细胞株HEK293，以稳定转染抗性筛选剂G418筛选后，获得了多株D5受体单克隆细胞。随后采用cAMP响应阳性（CRE）药forskolin和D5受体特异性激动剂SKF38393进行刺激，摸索出D5受体激动剂高通量筛选的最佳条件。利用该细胞筛选模型，该课题组对200余种中药水提物进行了初步筛选，从中选出了3种可明显激活D5受体的中药水提物，为D5受体激动剂的筛选打下基础。

3 生物大分子层次的活性评估法

细胞信号转导理论的发展同时催生了生物大分子层次的中药成分活性评价及筛选方法。该方法属于靶受体或酶的体外筛选模式，其思路是如果已证实某关键的信号通路与某生理、病理环节密切相关，那么以该信号通路上的关键受体、酶为探针，从众多中药成分中筛选靶受体的激活剂、抑制剂，或靶酶的催化剂、抑制剂、底物；从而发现候选药物。核心技术是把关键的受体、酶从组织细胞内分离纯化出来，选择合适的对照品，在合适的反应体系中与各种中药提取物、部位、组分等成分共同孵育，利用灵敏的检测器通过光吸收等原理检测是否发生免疫结合或酶促反应。在分子层次对中药成分进行生物学活性评估，不依赖动物模型与细胞、受试样品需要量少、实验周期短、费用低、操作过程可实现自动化，因而极大提高了筛选的通量与规模。目前，中药学、天然药物学界的许多学者将摸索成熟的活性检测技术与各种色谱、质谱技术等联合应用，建立了多种中药活性成分高通量筛选技术模式，发现了多种新的天然活性成分，或多种中药成分的新的生物学活性。

3.1 普通体外筛选模式

这种筛选方式中，中药成分的活性检测与不同成分的分离分析、结构鉴定分别进行。其基本思路是利用纯化的特定酶、受体，先检测中药粗提物或部位的活性，选择其中活性显著部位，利用色谱、质谱技术进行精细的成分分离、鉴定。α-葡萄糖苷酶抑制剂类成分可抑制小肠内α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，从而有效降低餐后高血糖。许芹永等^[11]利用体外抑制模型，从肉桂Cinnamomum cassia Presl. 的石油醚提取物中筛选出了α-葡萄糖苷酶抑制剂桂皮醛（cinnamal- dehyde）、肉桂酸（cinnamic acid）。酪氨酸酶是皮肤黑色素形成过程中的关键酶，该酶的抑制剂可能具有美白护肤的功效。通过检测丹参不同极性溶剂提取部位对酪氨酸酶活性的抑制作用，发现丹参氯仿萃取层具有较强的酪氨酸酶抑制活性，其中起主要作用的是丹参素（tanshinol）、原儿茶醛（protocate- chuicaldehyde）^[12]。朴香兰等^[13]利用相似的方法从连翘Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 筛选到了酪氨酸酶抑制成分白桦脂酸（betulinic acid）。

3.2 生物色谱技术

生物色谱技术是一种新兴的亲和色谱技术，以有活性的细胞膜、生物大分子作为靶标固着在色谱填料上形成固定相，以各种缓冲溶液为流动相。中药提取物作为溶质添加在流动相中。中药提取物经过色谱柱时，其中不同成分与靶标作用程度、结合性能不同，从而在固定相上表现出不同的保留行为。根据保留行为的差别，结合使用高分离效能的HPLC、高分辨率的质谱检测技术，具有不同生物学活性的成分即被筛选、分离出来。根据不同的固定相，生物色谱技术分为细胞膜色谱技术和大分子亲和色谱技术^[14]。

3.2.1 细胞膜色谱技术

细胞膜上存在多种受体，一般单个细胞的受体密度可达10³～10⁴数量级，是筛选多靶标中药活性成分的理想材料^[15]。血管内皮生长因子受体2（VEGFR 2）在血管内皮细胞（VEC）中表达丰富，该受体的激活对VEC发挥正常功能必不可少。李义平等^[16]以硅胶为载体制备ECV304细胞膜固定相，建立了VEC膜色谱模型，并利用该模型筛选红毛三七中的活性成分，并进行初步药理学验证，发现塔斯品碱（taspine）能够选择性地作用于VEGFR 2，并显著抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的血管管腔形成。利用相同的ECV304细胞膜色谱模型，蒙麦侠等^[17]以抗VEGF抗体为对照，发现竹根七的醋酸乙酯萃取部位中的ZGQ-C成分群和EVC细胞膜高度亲和，MTT法检测证实该成分显著抑制EVC的增殖。

表皮生长因子受体（EGFR）在多种恶性肿瘤中过度表达，被激活后促进肿瘤细胞增殖、加速肿瘤转移和抑制肿瘤细胞凋亡。从中药中寻找EGFR拮抗剂或抑制剂是目前的研究热点。王嗣岑等^[18]采用高表达EGFR的HEK293细胞系制备细胞膜色谱固定相，将该色谱模型与高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）联用，从独活Angelica pubescens Maxim. f. 中筛选出与EGFR高度亲和的成分蛇床子素（osthole）。MTT及ELSIA检测证实蛇床子素显著抑制EGFR/HEK293细胞增殖，并可与EGFR结合。采用相似的方法，张宇洁等^[19]研究发现，蛇床子素也是长春七Libanotis buethorimensis (Fisch.) DC. 中与红细胞膜高度亲和，并对红细胞有细胞毒性的活性成分。Wang等^[20]采用A431细胞膜色谱和高效液相色谱/质谱从中药中筛选EGFR拮抗剂，发现苦参Sophora flavescens Ait. 中的氧化苦参碱（oxymatrine）和苦参碱（matrine）能够作用于EGFR。

佛手Citrus medica L. 是常用的抗血压中药，但有效成分尚不清楚。为从佛手中筛选舒张血管的有效成分，王艳微等^[21]采用血管平滑肌细胞膜色谱（VSM/CMC）模型，结合HPLC/MS分析，并经离体动脉舒张实验验证，确定了佛手柑内酯（bergapten）是该药的主要活性成分。与此类似，赵惠茹等^[22]用家兔胸主动脉血管细胞膜为固定相，从当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels 挥发油中分离出对主动脉血管有舒张作用的2种有效成分。Yang等^[23]建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞膜色谱，并结合液-质联用（LC-MS）分析技术，从五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. 与南五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils. 中筛选出了具有血管扩张活性的成分去氧五味子素（deoxyschisandrin）和五味子酯甲（schisantherin A）。采用大鼠心肌细胞膜色谱柱，结合高效液相-飞行时间质谱（TOF/MS）分析，曹岩等^[24]从附子Aconitum carmichaeli Debx. 中初步筛选、鉴定出8个与心肌细胞膜高亲和性的成分，主要有单酯型的苯甲酰乌头胺（benzoylaconine）、苯甲酰新乌头胺（benzoylmesaconine）和苯甲酰次乌头胺（benzoylhypaconine）。Hou等^[25]以硅胶为载体制备MDA-MB-231细胞膜固定相，结合2D LC-MS分析技术，筛选厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils.中具有抗乳腺癌活性的成分，结果发现和厚朴酚（honokiol）和木兰醇（magnol）为其主要抗乳腺癌活性成分。

固定相采用动物细胞膜，细胞膜色谱技术能够较好地模拟活性成分与细胞膜及膜蛋白的相互作用，但由于离体细胞膜容易失活，使得色谱柱的寿命较短。

3.2.2 生物大分子亲和色谱技术

与细胞膜色谱技术不同，大分子亲和色谱技术是将有活性酶、受体、DNA、抗体、血浆中的运输蛋白或具有其他重要生理功能的生物大分子预先分离、纯化出来，然后直接与色谱填料相偶联，并制备成色谱柱。色谱柱上的成分单一，能排除非目的分子的干扰。

郑晓晖等^[26]从家兔肺组织中纯化得到β₂-肾上腺素受体（β₂-AR），以大孔硅胶为载体，建立了β₂-AR亲和色谱方法，从苦杏仁Armeniacae Amarum Semen中筛选出了可与β₂-AR相结合的活性成分苦杏仁苷（amygdalin）。王芳焕等^[27]采用羰基咪唑法合成人血清白蛋白（HAS）与大孔硅胶相结合的生物色谱填料，并使用该色谱柱从铁棒锤Aconitum pendulum Busch 中筛选出了与HAS相结合的4种活性物质脱乙酰去氧乌头碱（deacetylated deoxyaconitine）、苯甲酰脱氧乌头碱（benzolde- oxyaconitine）、乌头原碱（aconine）、苯甲酰新乌头原碱（benzoylmesaconine）。

生物色谱技术实现了中药活性成分筛选和分离的一体化，也提高了从复杂体系中识别目标成分的特异性、敏感性和选择性，目前在其推广和应用方面却存在一些困难^[28]：其一，由于各种中药活性成分在生物体内的作用靶点不同，所以色谱柱制备时选用的生物活性物质、固定相材料也不同，使得生物色谱固定相的制备困难。其二，色谱分离的条件和保持固定相生物活性的条件不能同时兼顾。其三，由于固定相含有蛋白质或其他生物大分子，大分子亲和色谱的分离能力与常规的高效液相色谱（HPLC）相比较低。其四，生物色谱柱特异性保留的中药活性成分的量一般都较少，也难以收集到足够的量供分子结构鉴定使用^[29]。

3.3 HPLC柱后生物活性联机检测技术

HPLC柱后生物活性联机检测技术是将分离功能强大的HPLC技术、成熟的生物活性体外生化检测技术联合使用，实现了化学分离与活性检测的同步进行，克服了传统药物筛选方法存在的操作繁琐、成本高等缺点，已被广泛地应用于中药或天然产物中抗氧化剂、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、血管紧张素转移酶（ACE）抑制剂、细胞色素P450抑制剂等的筛选^[30]。

3.3.1 天然抗氧化剂筛选

利用抗氧化剂的还原性，从HPLC中流出的成分在反应单元中与特定的氧化剂反应，检测反应前后吸收光谱的变化，来进行抗氧化活性成分筛选。根据所用氧化剂的不同，该方法可分为1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二盐（ABTS）法和磷钼络合物法^[31]。DPPH在溶液中显紫色，在517 nm处有最大吸收；与抗氧化剂作用，生成结构稳定的DPPH-H，在517 nm的吸收峰消失，在色谱图中形成倒峰^[32]。与此类似，ABTS^•+在743 nm处有最大吸收。抗氧化剂可使其转变成结构稳定的ABTS，在色谱图中743 nm处形成倒峰^[33]。而具有抗氧化活性的化合物与6价的磷钼试剂进行反应，生成5价的蓝色磷钼络合物，其倒峰的位置处于598 nm处^[34]。10多年来，利用该技术筛选出的天然抗氧化剂近50种^[30]。

利用HPLC-ABTS技术，耿雪飞等^[35]对细叶杜香Ledum palustre L. 茎部的抗氧化活性成分进行了筛选、分析，发现该药材甲醇提取物抗氧化活性显著。经核磁共振从该提取物的二氯甲烷萃取层鉴定出一种成分为秦皮素（fraxetin）。He等^[36]也利用此技术从栀子Gardenia jasminoides Ellis中检测出了具有清除自由基活性的化学成分，其中异绿原酸A（isochlorogenic acid A）为最主要的抗氧化成分。利用HPLC-DPPH法，王小淞等^[37]系统检测了黄芩Scutellaria baicalensis Georgi根、茎、叶提取物的抗氧化活性，发现不同部位提取物抗氧化活性成分差异显著，并比较了10个不同产地的黄芩根提取物中抗氧化活性成分，结果显示其都含有黄芩素（baicalein）、黄芩苷（baicalin）、二氢黄芩苷（dihydrobaicalin）、降汉黄芩素（norwogonin）、野黄芩苷（scutellarin）这5种抗氧化活性成分。

3.3.2 酶抑制剂筛选

生物体内某些酶的底物和产物光吸收谱差异较大。HPLC柱后活性联机检测技术正是利用了这种性质，筛选AChE、PDE、ACE及细胞色素P450的抑制剂的。AChE可催化乙酰胆碱生成5′-硫醇基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2- nitrobenzoate，λ_max＝405 nm）^[38]。PDE可以和2′-(N-甲基邻氨基苯甲酰)环磷酸鸟苷、腺苷（mant-cGMP、mant-cAMP）反应，分别生成2′-(N-甲基邻氨基苯甲酰)磷酸鸟苷、腺苷（mant-GMP、mant-AMP），与mant-cGMP、mant-cAMP相比，mant-GMP、mant- AMP的荧光强度明显降低^[39]。而ACE催化abz-FRK(dnp)P-OH生成荧光物质abz^{[39, 40]}。细胞色素P450催化乙氧基卤试灵生成荧光物质卤试灵^[37]。当上述酶的抑制剂存在时，反应产物的量显著减少。中药成分经HPLC分离后，柱后进入活性检测单元，与检测试剂作用，在适当的波长检测吸光度，具有抑制活性的成分会呈现倒峰^{[38, 39, 40, 41]}。

HPLC柱后活性联机检测技术虽然操作简便、筛选速度快、专属性高，但不能阐明活性成分的作用通路，而且色谱分离得到多种化学成分非常少，难以产生明显的峰响应。

4 结语

中药成分的复杂性及作用靶点的多样性决定了对其进行生物学活性评估的艰巨性。整体动物层次的药效评估虽然结果最接近人体试验，也符合中药多靶点作用的特点；然而需要的受试样品量多、工作量巨大。多数中药成分在药材中量较少，无法用这种方法进行活性评估。体外细胞、分子层次的活性评价方法提高了从复杂中药成分体系中识别目标成分的特异性、敏感性，也能实现大规模、高通量筛选；然而只能验证特定成分在特定细微的生化环节上具有活性，不能代表该成分在体内有药用效果；而且也忽略了中药多成分、多靶点、协同作用的特点，脱离了中医理论的指导，也无法真正寻找到中药活性成分。因而，中药成分的生物学活性评价及筛选不存在通用方法。以活性为导向，体内、体外多种方法相结合，才能对多种多样的中药成分进行全面、客观的活性评估，及筛选到确实有效的活性成分。