近年来，从中药中和已有的化合物库中寻找活性成分作为小分子靶向性药物，已成为抗肿瘤药物的研究方向。肿瘤细胞中普遍存在信号转导通路的失调，研发抑制这些通路中关键基因“Driver”的分子靶向药物或者多靶点的药物，将是肿瘤靶向治疗的重要发展方向。

研究表明，和厚朴酚能够以时间及剂量依赖性方式诱导乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤细胞的凋亡以及抑制肿瘤细胞增殖^{[1, 2, 3, 4]}。另外，和厚朴酚在抗肿瘤治疗中毒副作用低，在有效的治疗浓度下，正常细胞如成纤维细胞、淋巴细胞对其有很好的耐受性^[5]，表明和厚朴酚是一种具有开发潜力的抗癌小分子。在鼻咽癌的早期诊断、早期治疗及相关研究中，有关厚朴酚与和厚朴酚抑制鼻咽癌肿瘤细胞增殖、促进凋亡、抑制新生血管生成的研究等鲜有报道。本研究拟探讨厚朴中小分子化合物厚朴酚与和厚朴酚对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制，以期为厚朴酚与和厚朴酚抗肿瘤活性开发提供实验依据和理论基础。

鼻咽癌细胞株HONE1、HK1、CNE1、CNE2、5-8F均购自中国科学院细胞库，对照细胞人鼻咽上皮细胞NP460由北京大学香港科技大学医学中心万峻博士惠赠。基础培养基H-DMEM、胎牛血清（FBS）、左旋谷氨酰胺、青霉素和链霉素（Gibco-BRL），0.25%胰酶（Gibco）。厚朴酚、和厚朴酚（质量分数均为99%）由广州中医药大学李康博士惠赠。MTT（Sigma-Aldrich），Matrigel基质胶（BD Bioscience），Transwell小室（聚碳脂膜微孔直径8 μm，Costar）。

肿瘤细胞于培养皿中培养，完全培养基包括90%基础培养基H-DMEM、10% FBS、1 mmol/L左旋谷氨酰胺、1%双抗（100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素）。37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。

将1×10³个肿瘤细胞HONE1接种于96孔板中，每孔200 μL，24 h后分别加入不同质量浓度（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μg/mL）的厚朴酚与和厚朴酚，同时设对照组（正常细胞加培养基），每组设6个复孔，于加药后48 h采用MTT法测定490 nm波长处吸光度（A）值。

接种约8.0×10⁵个肿瘤细胞HONE1于6孔板中，细胞汇合度至90%时，用200 μL枪头在单细胞层上划痕，分别加入不同质量浓度（5、10、15 μg/mL）的厚朴酚与和厚朴酚，同时设置对照组（正常细胞加培养基），分别于划痕后0、24、48、72 h观察细胞迁移情况，并拍照。

按照说明书将Matrigel基质胶与无血清培养基以1∶3稀释混匀预铺在Transwell小室（上室）内至凝固后，分别将5×10⁴个HONE1或NP460的无血清细胞悬液（参照Transwell小室说明书）接种至Transwell小室内，并放置于24孔板小室（下室）内含有7.5 μg/mL厚朴酚的10%胎牛血清完全培养基中。37 ℃、5% CO₂培养18 h后，用棉签擦去基质胶和上室内细胞，结晶紫染色固定后，在显微镜下（×100）拍照计数。

本实验建立了人鼻咽癌细胞株HONE1、HK1、CNE1、CNE2、5-8F及对照细胞人鼻咽上皮细胞NP460细胞稳定的培养、扩增体系，各细胞形态见图 1。

图 1 5株鼻咽癌细胞系及对照细胞系NP460的形态学特征Fig. 1 Morphologic characters of five nasopharyngeal carcinoma cell lines and control NP460 cell line

采用MTT法测定不同质量浓度的厚朴酚、和厚朴酚对HONE1细胞的增殖抑制率。结果表明，厚朴酚、和厚朴酚均对HONE1的增殖有抑制作用，并且这种抑制作用呈明显的量效关系，厚朴酚、和厚朴酚作用HONE1细胞48 h的IC₅₀值分别为4.56、7.98 μg/mL，具体抑制率见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 厚朴酚与和厚朴酚对HONE1细胞增殖的抑制作用( x±s , n=6) Table 1 Inhibition of magnolol and honokiol on proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1( x±s , n=6) 组别 ρ/(μg∙mL-1) A值 抑制率/% 组别 ρ/(μg∙mL-1) A值 抑制率/% 对照 — 0.28±0.03 — 对照 — 0.24±0.01 — 厚朴酚 2.5 0.22±0.04 2.89 和厚朴酚 2.5 0.19±0.02 20.92 5.0 0.18±0.03 20.12 5.0 0.13±0.02 78.81 7.5 0.12±0.01 43.17 7.5 0.09±0.01 90.22 10.0 0.07±0.05 75.66 10.0 0.07±0.01 98.06 12.5 0.02±0.01 88.09 12.5 0.01±0.01 100.00 15.0 0.00±0.03 99.02 15.0 0.00±0.03 100.00

表 1 厚朴酚与和厚朴酚对HONE1细胞增殖的抑制作用( x±s , n=6) Table 1 Inhibition of magnolol and honokiol on proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1( x±s , n=6)

分别采用不同质量浓度的厚朴酚、和厚朴酚对鼻咽癌细胞系HONE1进行处理，通过倒置相差显微镜观察到，未经药物处理的细胞贴壁良好，细胞轮廓清晰，细胞连接紧密，处理细胞48 h后，肿瘤细胞显示出不同程度变小、变圆，至培养72 h后，细胞折光率减弱，细胞崩解，细胞质浓缩，凝固等，细胞凋亡显著较对照组明显。进一步进行细胞划痕实验，可观察到添加厚朴酚或和厚朴酚24 h后，处理组HONE1细胞迁移受到明显抑制，并呈剂量依赖性，结果见图 2。

图 2 厚朴酚与和厚朴酚对鼻咽癌细胞系HONE1迁移的影响 (24 h)Fig. 2 Effect of magnolol and honokiol on migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 (24 h)

进一步采用铺有Matrigel基质胶的COSTAR Transwell小室检测了厚朴酚对鼻咽癌细胞HONE1和人鼻咽上皮细胞NP460侵袭能力的影响。实验结果表明，厚朴酚能显著抑制鼻咽癌细胞HONE1的侵袭，而对NP460细胞的抑制作用不显著（图 3）。

图 3 厚朴酚对鼻咽癌细胞HONE1侵袭的影响 Fig. 3 Effect of magnolol on invasion of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区一种常见的恶性肿瘤，尤以广东省珠江三角洲一带多见，发病率较欧美等其他国家高25～30倍^{[9, 10]}，故有“广东瘤”之称^{[11, 12, 13]}。目前研究发现，鼻咽癌的发病与爱波斯坦-巴尔病毒（Epstein. Barr virus，EBV）感染、遗传因素以及环境因素密切相关。尽管以调强放射治疗技术为主的放化疗综合治疗使得鼻咽癌的局控率有明显提高，但鼻咽癌起病隐匿、转移早、易复发，5年生存率仍维持在70%左右^{[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]}，鼻咽癌的发病人群以40～50岁的青壮年多见，一旦发病对社会、经济和家庭造成较大影响。因此，全面解析鼻咽癌的病因及其癌变的分子机制对于鼻咽癌的早期发现和患者生存率的提高具有重要意义。

厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia offieinalis Rehd. et Wils、凹叶厚朴Magnolia offieinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils的干燥树皮、根皮以及枝皮。厚朴是一味具有广泛药效作用的中药，在国内外用于多种疾病的治疗。和厚朴酚是从厚朴的根、茎、叶中提取的一种小分子的天然产物，属于带有烯丙基的联苯酚类化合物，是厚朴的主要活性成分，其具有多种药理作用，其中抗肿瘤作用是其重要作用之一，可以通过诱导肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞分化，抑制肿瘤新生血管生长，抑制肿瘤转移，抑制细胞增殖等效应发挥抗肿瘤作用，其抗肿瘤效应具有多靶点、多效应、毒副作用低的特点^{[21, 22]}，在抗肿瘤治疗中受到越来越多的关注^[23]。

近年来，分子肿瘤学、分子药理学的发展使肿瘤本质正在逐步阐明^[24]。恶性肿瘤的侵袭和转移是其治疗失败的原因之一，抑制肿瘤的侵袭与转移是目前肿瘤治疗研究的热点^[25]。目前，中医药配合现代医学技术在预防和治疗肿瘤的许多方面能取长补短。本研究考察厚朴中2种酚类小分子化合物对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响，结果表明厚朴酚与和厚朴酚能明显抑制鼻咽癌细胞系增殖、迁移和侵袭，而且这种作用效应呈显著的剂量依赖性，提示这类小分子化合物可能对鼻咽癌发生、发展具有重要调控作用。厚朴酚与和厚朴酚属同分异构体，本实验中，将2种化合物以相同质量浓度分别作用于鼻咽癌细胞系，从实验结果分析，它们对鼻咽癌细胞系细胞形态及迁移、细胞生长抑制以及细胞侵袭均有显著效应，初步说明它们抗癌效价和抗癌作用是相似的。2种化合物在鼻咽癌中的信号通路以及小鼠模型血清中内源性代谢物的变化，需要进一步的鉴定和筛选。