神经毒素（NT）是眼镜蛇毒的主要成分之一。因其具有良好的中枢镇痛作用，无耐受性和依赖性，安全性高，临床上主要以肌肉注射方式用于镇痛和戒毒^[1]。但由于其相对分子质量较大（约6 700），脂溶性小，不易透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），起效缓慢，故在一定程度限制了其临床应用。纳米粒（nanoparticles，NPs）被认为是脑内药物传递系统的良好载体，具有缓释、保护药物的作用。鼻腔给药可以实现脑靶向给药，但鼻腔黏膜吸收能力十分有限，需要加入吸收促进剂以促进鼻黏膜对药物载体的吸收^[2]。

前期研究发现，经聚山梨醇-80（polysorbate-80，P-80）表面修饰的神经毒素纳米粒（P-80-NT-NP）经鼻腔给药后可快速入脑，脑内消除相明显延长，通过抑制脑微毛细血管内皮细胞高效的外排泵作用，尤其能抑制具有外排作用的P-糖蛋白（P-gp）的活性，从而提高脑内药物浓度，该研究成果表明以P-80修饰的NPs为载体经鼻腔给药，是实现肽类大分子入脑的有效途径^{[3, 4]}。本研究采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的方法，观察FITC标记的P-80-NT-NP在大鼠体内的分布，旨在研究表面P-80修饰后纳米递药系统在血浆、脑、心、肝、脾、肺、肾中的代谢和分布，为神经毒素新剂型的开发应用提供依据。

神经毒素由上海紫一试剂厂提供，质量分数＞99%，批号ZY130114；FITC购自美国Sigma公司；聚氰基丙烯酸正丁酯由北京康派特医疗器械有限公司提供；泊洛沙姆和右旋糖苷购自德国BASF公司；P-80购自上海山浦化工有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

岛津RF-5000型荧光分光光度计（日本岛津公司）；380 ZLS激光粒度测定仪/Zeta电位仪（美国NICOMP公司）；FHS-2A可调高速匀浆机（金坛市宏华仪器厂）；TJ-25低温高速冷冻离心机（Beekman Coulter公司）；大鼠鼻黏膜给药装置（浙江省中药制剂工程中心）。

清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量279～290 g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（沪）2007-0005。动物室每天灯光照明12 h，通风和空调设备良好，室温控制在（23±1）℃，相对湿度为50%～70%。实验室按常规定期消毒。

取40只SD大鼠，取4只以生理盐水给药作为空白对照组：用于制备空白血浆和组织样品，其余36只随机分为2组（每组18只）：P-80-NT-NP组和神经毒素纳米粒（NT-NP）组，以鼻腔给药装置^[5]经鼻腔给药。给药前大鼠禁食10 h，自由饮水。

称取泊洛沙姆Pluronic-68和稳定剂右旋糖苷-70各150 mg，加蒸馏水25 mL溶解，加入FITC标记的NT（FITC-NT）溶液（1 mg/mL）60 μL，调节pH值至2.0，缓慢加入聚氰基丙烯酸正丁酯（PBCA） 60 μL，匀速搅拌2 h（800 r/min），调节pH值至7.0，滤过，定容，得NT-NP胶体溶液，加入适量P-80搅拌，37 ℃恒温箱中孵化1 h，超速离心30 min（40 000 r/min），去除多余P-80，冻干，即得P-80-NT-NP。

将经FITC标记的P-80-NT-NP胶体溶液，滴于覆盖碳膜的铜网上，用磷钨酸溶液钠负染，室温放置至形成薄膜后用透射电子显微镜观察其形态，并拍摄照片。

将经FITC标记的P-80-NT-NP胶体溶液，用Zeta电位/粒度分布仪测定Zeta电位、平均粒径及多分散系数（PDI）。

取P-80-NT-NP胶体溶液，超速离心30 min（40 000 r/min），取上清液，采用荧光分光光度法，选择λ_ex＝488 nm作为激发波长，于发射波长520 nm处读取FITC标记的P-80-NT-NP溶液的荧光强度值，激发光谱的狭缝宽度为5 nm，发射光谱的狭缝宽度为10 nm。以荧光强度值换算其中所含NT的量，按下列公式计算纳米粒的包封率和载药量。

包封率＝(C₀－C₁)/C₀

载药量＝(C₀－C₁)/M

C₀为投入NT的初始浓度，C₁为离心后NT的浓度，M为冻干后的纳米粒的质量与胶体溶液的体积的比值

精密称取恒温下干燥至恒定质量的FITC-NT，配制1 mg/mL的储备液；再以甲醇进行梯度稀释，制备质量浓度分别为500、250、100、50、25、10、5、1 μg/mL的FITC-NT对照品溶液。分别精密吸取空白血浆100 μL或组织（脑、心、肝、脾、肺、肾）匀浆样品300 μL，根据不同标准曲线的浓度范围，分别加入不同质量浓度的FITC-NT对照品溶液100 μL，制成一系列质量浓度的模拟生物样品，分别加入甲醇100 μL，漩涡混匀。加入醋酸乙酯涡旋提取后，吸取有机层，氮气吹干。残渣用200 μL甲醇溶解，涡旋混匀，1.2×10⁴ r/min 离心5 min，取上清液100 μL，加入96孔板，用荧光分光光度计测定荧光强度，设置FITC的激发波长488 nm，发射波长520 nm。以质量浓度为横坐标（X），荧光强度值为纵坐标（Y），用加权（W＝1/x²）最小二乘法进行回归运算，求得直线方程，即为NT标准曲线。

除对照组外，给药时将清醒大鼠半仰位固定在大鼠鼻黏膜给药装置上，将PE-10管插入大鼠右侧鼻腔约15 mm，使用有柔软PE-10管的微量泵给药（NT剂量为60 μg/kg）。分别于给药后5、15、30、60、120、240 min这6个时间点，每个时间点3只大鼠，分批断头处死，采集血样，并收集脑、心、肝、脾、肺、肾等组织。血样静置离心（1×10⁴ r/min，5 min）得血浆，于−20 ℃保存备用。其余的组织样品，用生理盐水冲洗表面血污后，用滤纸吸干各组织表面残血并称质量，按质量与体积比为1∶2加生理盐水，制备成匀浆。精密吸取大鼠血浆100 μL或组织（脑、心、肝、脾、肺、肾）匀浆样品300 μL，分别加入甲醇100 μL，涡旋混匀。加入醋酸乙酯涡旋提取后，吸取有机层，氮气吹干。残渣用200 μL甲醇溶解，涡旋混匀，1.2×10⁴ r/min 离心5 min，取上清液100 μL，加入96孔板，用荧光分光光度计测定荧光强度。根据荧光强度，按标准曲线方程求出NT在血浆或各个组织中的质量浓度。所有统计的实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验。

FITC标记的P-80-NT-NPs在电镜下观察呈圆球形，表面光滑，大小均匀（图 1）。测得的平均粒径为（73.4±9.8）nm，Zeta电位为（−18.2±5.4）mV，包封率为（74.0±6.3）%，载药量（0.119±0.030）%。

图 1 P-80-NT-NP 电镜图 Fig.1 TEM photograghs of P-80-NT-NP

按照“2.4”项方法计算得到不同生物样品中NT的标准曲线，空白生物样品荧光强度与药物质量浓度成良好的线性关系，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 不同生物样品中NT的标准曲线 Table 1 Standard curves of NT in different biological samples 生物样品 回归方程 r2 线性范围/ (μg∙mL−1) 血浆 Y＝6.563 X－30.65 0.991 0.1～100.0 心 Y＝5.738 X－71.44 0.994 1.0～100.0 肝 Y＝5.558 X－57.83 0.992 1.0～100.0 脾 Y＝5.17 X－79.88 0.993 1.0～100.0 肺 Y＝4.46 X－115.67 0.991 1.0～100.0 肾 Y＝3.99 X－98.1 0.992 1.0～100.0 脑 Y＝3.67 X－18.29 0.993 0.5～100.0

表 1 不同生物样品中NT的标准曲线 Table 1 Standard curves of NT in different biological samples

P-80-NT-NP和NT-NP经鼻腔黏膜给药120 min后在大鼠各组织分布情况见图 2，P-80-NT-NP和NT-NP在血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中均有分布。P-80-NT-NP给药组血浆、脑中NT的质量浓度高于NT-NP组，而在肝组织中低于NT-NP组，差异均显著（P＜0.05）。P-80-NT-NP鼻黏膜给药，脑中NT质量浓度为（0.236±0.100）μg/mL，NT-NP鼻黏膜给药，脑中NT质量浓度为（0.158±0.070）μg/mL，两组间比较差异显著（P＜0.05）。

图 2 P-80-NT-NP 和 NT-NP 鼻腔黏膜给药 120 min 药物在大鼠各组织分布情况 Fig.2 Tissue distribution of P-80-NT-NP and NT-NP after 120 min of administration in rats

P-80-NT-NP经鼻腔黏膜给药后5、15、30、60、120、240 min 6个时间点药物在大鼠各组织分布情况见图 3。结果表明P-80-NT-NP在脑、心、肝、脾、肺、肾各组织中均有分布，其中以肝组织中分布最高，肾组织其次。肺、脑、肝、脾组织中，NT质量浓度5 min即达到峰值，而在肾、心组织中15 min达到峰值，之后随时间逐渐下降。NT-NP给药后药物在各组织中质量浓度变化趋势与P-80-NT-NP相似。

图 3 P-80-NT-NP 给药后不同时间点药物在大鼠体内组织分布 Fig.3 Tissue distribution of P-80-NT-NP in rats at different time points after administration

P-80-NT-NP在脑、心、肝、脾、肺、肾各组织中均有分布，P-80-NT-NP在血浆和各组织的质量浓度从高到低依次为血浆＞肝＞肾＞脾＞肺＞心＞脑。脑、肝、肺和脾在P-80-NT-NP给药5 min后达到药物浓度最高值，心、肾在给药15 min后达到最高值，然后迅速降低，说明P-80-NT-NP的吸收、分布及消除迅速。所考察组织中NT-NP在肝中的药物量较高，与P-80-NT-NP组有显著性差异（P＜0.05），提示NT-NP与肝组织亲和力较好，且在肺部消除慢。可能NT-NP经鼻腔黏膜给药后逃逸吞噬进入血液循环，载药纳米粒进入血液循环后，在调理素的作用下，被血浆蛋白、糖蛋白等多种成分吸附，随即被肝脏中网状内皮系统吞噬^[8]。

大鼠体内的组织分布研究发现，P-80-NT-NP和NT-NP在肾脏中的量均较高，两组间差异无显著性（P＞0.05）。推测可能是P-80-NT-NP和NT-NP降解的部分携带着多肽从组织上被重吸收到血液循环，再重新分布到各组织^[9]；此外肾脏可能对NT起着解毒和分泌排泄的作用。

有学者用氯胺T法标记NT，大鼠iv给予¹²⁵I-NT，观察其在体内的分布情况，30 min及120 min后分布最多的均为心脏，肾脏以外的实质性脏器分布均较少，脑中分布最低^[10]。经P-80修饰后，即P-80-NT-NP鼻黏膜给药120 min，脑中药物的量为（0.236±0.100）μg/mL，NT-NP组脑中药物的量显著低于P-80-NT-NP组（P＜0.05）。提示P-80-NT-NP与脑组织亲和力较好，提高脑组织的靶向分布，且消除缓慢。NT-NP经P-80修饰后，BBB透过性增强，靶向至脑组织分布，使药物量显著增大，这有利于NT发挥镇痛作用。P-80修饰的NP可以将血浆中的载脂蛋白E（ApoE）或载脂蛋白B（ApoB）吸附至其表面，利用ApoE/ApoB能与脑微血管内皮细胞（BMEC）上低密度脂蛋白（LDL）受体结合的特点，借助受体介导的胞饮作用穿过BBB并直接扩散至脑内释药^[11]。

综上所述，P-80-NT-NP可显著增加NT经鼻腔吸收入脑，而且消除缓慢，同时揭示了该药物经鼻腔黏膜给药入脑后，药物在大鼠体内的分布规律。本研究所使用的大鼠脑、血浆及组织内FITC-NT量的荧光分析方法简便、快速、准确，为其他大分子多肽类的药动学研究提供了方法学参考。此外，关于P-80-NT-NP如何促进鼻腔吸收入脑的分子蛋白通路尚不明确，有待进一步研究。