三七是我国名贵中药材，据《本草纲目》记载，三七“止血散血定痛，金刃箭伤、跌扑杖疮、血出不止者，嚼烂涂，或为末掺之，其血即止”，表明三七外用具有显著的止血功能。在现代的中药制剂中，云南白药气雾剂、创可贴等止血功效外用制剂中均含有三七。近年来，已有大量文献针对三七的体外经皮渗透活性做出研究^{[1, 2, 3, 4]}。三七素（dencichine，β-N-oxalyl-L-α,β-dimainopropinoieaeid）作为三七中止血活性最强的单体成分^[5]，能够显著影响凝血系统的凝血因子和血小板聚集，从而缩短凝血时间和出血时间^{[6, 7, 8, 9]}。但目前针对三七素的体外透皮吸收特性研究领域尚属空白。因此本实验对三七素皮肤渗透特性做出研究，为三七素在经皮给药系统中的开发和应用提供理论基础和实验依据。

YB-P6智能透皮试验仪，天津天光光学仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；ZWY-111B恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司。

三七素对照品，批号MR91890，相对分子质量为176.13，HPLC测定质量分数≥98%，上海铭睿生物有限公司；水溶性月桂氮酮（azone，AZ），砀山县龙精细化工有限公司；N-甲基-2-吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP），西陇化工股份有限公司；薄荷脑（menthol）、1,2-丙二醇（propylene glycol，PG），天津市致远化学试剂有限公司；色谱级甲醇，美国Sigma公司；水为超纯水；其他试剂为分析级。

昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌性，昆明医科大学实验动物中心提供；猪，体质量（30±2）kg，雌性，购于当地屠宰场。

2.1.1 色谱条件 岛津LC-20AB高效液相色谱仪，Thermo Scientific Hypersil GOLD C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.3%四丁基氢氧化铵（A）-甲醇（B）（磷酸调pH值为4.0），梯度洗脱：0～15 min，15%～20% A；15～25 min，20%～15% A；体积流量1 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长220 nm。

取适量三七素对照品，精密称定，用水定容于10 mL量瓶中，制成质量浓度为0.88 mg/mL的三七素对照品储备液。精密吸取储备液2、20、100、400、1 000 μL加水分别配制成质量浓度为1.76、17.60、88.00、176.00、352.00、880.00 μg/mL三七素对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项色谱条件测定。以峰面积积分值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得三七素的回归方程为Y＝2×10⁶ X－3 079，r＝0.999 3，表明三七素在1.76～880.00 μg/mL线性关系良好。

将体外经皮实验取出的接收液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

精密称取“2.1.2”项下880.00 μg/mL对照品溶液，连续进样6次，进样体积10 μL，记录峰面积，结果三七素峰面积的RSD为0.78%，表明仪器的精密度良好。

取三七素对照品溶液5份，经体外皮肤实验的接收液，按上述色谱条件测定峰面积，计算RSD值为3.58%（n＝5），结果表明该方法的重复性良好。

取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别于0、1、2、4、8、12、24、36、48 h进样，每次10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定三七素峰面积，计算其RSD为0.94%，结果表明供试品溶液中三七素在48 h内稳定性良好。

精密称取已知质量浓度三七素供试品1 mL，分别加入88.00、35.20、17.60 μg/mL三七素对照品溶液1 mL，配制成2 mL溶液，按上述液相条件进样10 μL，测定峰面积，按回归方程计算回收率，结果平均回收率为98.4%，RSD为2.1%。

分别取三七素对照品溶液、三七素透皮接收液以及空白皮肤接收液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，色谱图见图 1。

图 1 三七素透皮吸收HPLC对比色谱图Fig.1 Comparison on dencichine transdermal absorption by HPLC

称取过量的三七素对照品于25 mL锥形瓶中，加入超纯水14 mL，超声30 min，配制过饱和溶液，并于36.5 ℃下350 r/min搅拌24 h后，使达到饱和状态，量取1 mL上述溶液4份，在3 000 r/min条件下离心5 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下方法测定。结果得到三七素表观溶解度为（981.04±17.61）mg/mL。

精密称取三七素过饱和溶液5 mL，加入正辛醇5 mL，摇匀，超声10 min，并于37 ℃摇床中闭光振动24 h，静置至溶液分层，取下层1 mL，过0.45 μm微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件测定三七素质量浓度。根据公式P＝(C₀－C_w)/C_w（其中C₀为药物在水相中的原始质量浓度，C_w为萃取后药物在水相中的质量浓度）计算三七素油水分配系数为lgP＝−1.66±0.04。

取昆明种小鼠剪去腹部毛发，处死后剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪及黏液组织，用生理盐水清洗，拭干。另取猪耳背皮肤，去除皮下脂肪、组织，用生理盐水清洗，拭干。放置−20 ℃冰箱冷藏备用。实验前24 h先将小鼠皮及猪皮在室温下自然解冻，用生理盐水清洗干净，用滤纸吸干表面水分，并在实验前对皮肤完整性和均匀性进行检查。

取一定量的三七素对照品，用水溶解制成一定质量浓度的供试药液（约为0.7 mg/mL）。

将处理好的皮肤（小鼠皮、猪皮）固定于Franz扩散池中，角质层面向供药池，并以配套的铁夹夹紧2个半池，在接收池中加入0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）溶液15 mL，加入磁子，池内温度控制为36.5 ℃，恒温磁力搅拌，加样前平衡30 min，排除接收池中气泡。分别在实验开始的0.5、1、2、4、6、8、10、12 h时取样1 mL，每次取样完毕后，补加等体积、等温度的PBS于接收池中。将已经取好的样品过0.45 μm微孔滤膜，待HPLC液相检测。按下列公式计算单位面积累积渗透量（Q，mg∙cm⁻²），结果见表 1。

C_n、C_i为第n个和第i个取样点测得的药物质量浓度，V_n为扩散池体积（15.0 mL），V_i为每次取样的体积（1.0 mL），A为皮肤扩散面积（1.327 cm²）

表 1(Table 1)

表 1 三七素的Q(x±sn = 3) Table 1 Q of dencichine(x±sn = 3) 时间/h Q/(mg∙cm−2) 小鼠皮 猪皮 0.5 0.014±0.013 0.008±0.008 1 0.060±0.015 0.019±0.004 2 0.123±0.036 0.030±0.002 4 0.204±0.038 0.051±0.003 6 0.245±0.033 0.063±0.008 8 0.272±0.039 0.078±0.008 10 0.310±0.048 0.092±0.006 12 0.338±0.067 0.100±0.005

表 1 三七素的Q(x±sn = 3) Table 1 Q of dencichine(x±sn = 3)

对三七素在不同皮肤下不同时间点Q进行零级方程（Q_t/Q_∞＝kt拟合）、一级方程［ln(Q－Q_t)＝lnQ_∞－kt］以及Higuchi方程拟合（Q_t/Q_∞＝kt^1/2），结果见表 2。通过3种拟合动力学方程线性关系及相关系数可知，三七素过饱和溶液在0～12 h内小鼠皮的Q_t/Q_∞与t^1/2拟合度最高，因此三七素溶液体外透皮吸收方程符合Higuchi方程。

表 2(Table 2)

表 2 三七素经皮渗透动力学拟合方程 Table 2 Fitting percutaneous dynamic equation of dencichine 拟合方程 方程表达式 小鼠皮 猪皮 拟合方程 r 拟合方程 r 零级 Qt/Q∞＝kt y＝0.035 9 x＋0.069 4 0.921 9 y＝0.010 6 x＋0.016 9 0.976 8 一级 ln(Q－Qt)＝lnQ∞－kt y＝0.049 3 x＋0.060 3 0.958 1 y＝0.011 6 x＋0.015 0 0.982 5 Higuchi Qt/Q∞＝kt1/2 y＝0.156 5 x－0.068 3 0.986 8 y＝0.045 1 x－0.021 4 0.997 7

表 2 三七素经皮渗透动力学拟合方程 Table 2 Fitting percutaneous dynamic equation of dencichine

三七素溶液在小鼠皮和猪皮的Q、稳态流量（J，mg∙cm⁻²∙h^−1/2）、渗透系数（P_m，cm∙h^−1/2）的考察，结果见表 3。根据Higuchi曲线斜率计算J和P_m（P_m＝J/C，C为供试溶液质量浓度），结果可知，三七素在小鼠皮中渗透效果高于猪皮。

表 3(Table 3)

表 3 三七素经皮渗透动力学参数 (x±s, n = 3) Table 3 皮肤 Q/(mg∙cm−2) J/(mg∙cm−2∙h−1/2) Pm/(cm∙h−1/2) 小鼠皮 0.338±0.067 0.027±0.005 0.039±0.007 猪皮 0.120±0.062 0.008±0.003 0.011±0.008

表 3 三七素经皮渗透动力学参数 (x±s, n = 3) Table 3

表 4(Table 4)

表 4 促渗剂对三七素的Q的影响(x±s, n = 3) Table 4 Effect of permeation enhancers on cumulative transdermal amount of dencichine(x±s, n = 3) 促渗剂 Q/(mg∙cm−2) 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 对照 0.014±0.013 0.060±0.015 0.123±0.036 0.204±0.038 0.245±0.033 0.272±0.039 0.310±0.048 0.338±0.067 5%薄荷脑 0.127±0.017 0.229±0.031 0.318±0.021 0.409±0.041 0.479±0.440 0.530±0.042 0.581±0.043 0.606±0.042 5% PG 0.095±0.026 0.174±0.047 0.249±0.060 0.306±0.089 0.368±0.031 0.417±0.068 0.466±0.064 0.492±0.053 5% NMP 0.095±0.015 0.197±0.022 0.285±0.024 0.391±0.178 0.468±0.017 0.523±0.005 0.585±0.007 0.637±0.003 5% AZ 0.049±0.032 0.086±0.058 0.148±0.040 0.201±0.040 0.249±0.087 0.303±0.023 0.387±0.030 0.423±0.035 1% NMP 0.060±0.024 0.110±0.063 0.140±0.069 0.185±0.080 0.219±0.093 0.274±0.133 0.295±0.133 0.351±0.133 3% NMP 0.067±0.028 0.118±0.047 0.191±0.072 0.301±0.092 0.358±0.034 0.433±0.109 0.468±0.110 0.513±0.090

表 4 促渗剂对三七素的Q的影响(x±s, n = 3) Table 4 Effect of permeation enhancers on cumulative transdermal amount of dencichine(x±s, n = 3)

表 5(Table 5)

表 5 促渗剂经皮渗透动力学参数(x±s, n = 3) Table 5 Percutaneous penetration parameters with permeation enhancers(x±s, n = 3) 促渗剂 Q/(mg∙cm−2) J/(mg∙cm−2∙h−1/2) Pm/(cm∙h−1/2) ER 对照 0.338±0.067 0.027±0.005 0.039±0.007 － 5%薄荷脑 0.606±0.042 0.038±0.017 0.054±0.024 1.385 5% PG 0.492±0.053 0.032±0.013 0.046±0.019 1.179 5% NMP 0.637±0.003 0.043±0.008 0.061±0.011 1.564 5% AZ 0.423±0.035 0.031±0.008 0.044±0.011 1.128 1% NMP 0.351±0.134 0.023±0.009 0.033±0.013 0.846 3% NMP 0.513±0.090 0.038±0.006 0.054±0.008 1.385

表 5 促渗剂经皮渗透动力学参数(x±s, n = 3) Table 5 Percutaneous penetration parameters with permeation enhancers(x±s, n = 3)

的促渗剂NMP进行不同浓度渗透性考察^[11]，发现3种用量NMP促渗剂对三七素均有促渗作用，其促渗能力大小为5% NMP＞3% NMP＞1% NMP。对不同促渗剂和不同用量NMP促渗剂时间点Q进行Higuchi方程拟合（表 6），结果表明相关系数（r）均在0.98以上。

表 6(Table 6)

表 6 不同促渗剂的方程拟合表达式(x±s, n = 3) Table 6 Equation fitting expression with different permeation enhancers(x±s, n = 3) 促渗剂 零级拟合方程 一级拟合方程 Higuchi拟合方程 对照 y＝0.035 9 x＋0.069 4，r＝0.921 9 y＝0.049 3 x＋0.060 3，r＝0.958 1 y＝0.156 5 x－0.068 3，r＝0.986 8 5%薄荷脑 y＝0.051 7 x＋0.272 5，r＝0.908 2 y＝0.121 2 x＋0.212 1，r＝0.979 8 y＝0.262 6 x＋0.072 5，r＝0.987 8 5% PG y＝0.042 9 x＋0.200 3，r＝0.930 6 y＝0.078 9 x＋0.189 9，r＝0.980 3 y＝0.186 1 x＋0.037 8，r＝0.986 4 5% NMP y＝0.058 4 x＋0.219 9，r＝0.934 9 y＝0.147 0 x＋0.130 4，r＝0.991 4 y＝0.252 8 x＋0.000 8，r＝0.990 4 5% AZ y＝0.042 3 x＋0.083 0，r＝0.982 6 y＝0.065 2 x＋0.054 0，r＝0.987 5 y＝0.178 1 x＋0.066 3，r＝0.985 3 1% NMP y＝0.030 9 x＋0.107 9，r＝0.974 7 y＝0.044 0 x＋0.099 4，r＝0.985 4 y＝0.130 9 x－0.002 5，r＝0.985 8 3% NMP y＝0.051 1 x＋0.135 5，r＝0.951 1 y＝0.092 7 x＋0.097 3，r＝0.992 0 y＝0.220 4 x－0.055 4，r＝0.996 7

表 6 不同促渗剂的方程拟合表达式(x±s, n = 3) Table 6 Equation fitting expression with different permeation enhancers(x±s, n = 3)

经皮给药是由皮肤吸收进入全身血液循环^{[13, 14, 15]}，而皮肤表面可视角质层是亲脂性很强的生物膜，药物的理化性质对经皮吸收能力有决定性作用。通常来说，相对分子质量小，lgP值在2～3的药物具有较好的经皮渗透特性。三七素是一种特殊的非蛋白质氨基酸，相对分子质量小，为176.13；溶解度大，表观溶解度为981.04 mg/mL；lgP值小，为−1.66±0.04，说明三七素亲水性强，对生物膜的渗透作用较弱。三七素虽然相对分子质量较小，有利于透过皮肤障碍，但是其lgP值很小，与皮肤相容性很差，因此，不易透过角质层。

皮肤的渗透系数只与药物性质和皮肤性质有关，值越大，则药物的经皮渗透越容易。小鼠皮和猪皮是药物经皮渗透研究中2种常用的皮肤模型。据文献报道，猪皮的角质层厚度约为26 μm，而小鼠皮角质层厚度仅为6 μm左右^[16]。三七素在小鼠皮J为0.027 mg∙cm⁻²∙h^−1/2，经皮P_m为0.039 cm∙h^−1/2；而猪皮J仅为0.008 mg∙cm⁻²∙h^−1/2，相对应的经皮P_m值为0.011 cm∙h^−1/2，说明三七素在小鼠皮透皮能力强于猪皮。同时，猪皮表面含油脂成分高，猪皮角质层厚于小鼠皮，水溶性物质三七素难从猪皮角质层中渗透过去^{[17, 18, 19]}。各种动物之间的解剖差异很大，不同动物的角质层厚度、单位面积汗腺数量与毛孔数量等均不同。本实验表明，三七素在小鼠皮中具有更好的经皮渗透特性。

通过考察三七素溶液体外渗透曲线，反映了三七素在皮肤的渗透特征^[20]。采用零级、一级以及Higuchi方程对渗透曲线进行拟合，以相关系数作为评判标准，得出Higuchi方程＞一级方程拟合＞零级方程。Higuchi模型是基于Fick扩散定律的药物释放模型，是目前常见药物释放模型中应用最多的一种。皮肤是药物经皮渗透的主要屏障，药物经皮吸收速率往往被皮肤的屏障作用所限制。皮肤作为药物贮库和限速膜，三七素在其中的扩散速率和扩散行为决定了药物的经皮吸收能力^{[21, 22]}。因此，三七素的体外经皮吸收可看作从通过皮肤限速膜的扩散与释放，三七素在皮肤中的扩散模型与Higuchi方程拟合较好。

为了增加三七素在皮肤上的通透性，选择了4种不同的促渗剂进行促渗作用评价，发现NMP对三七素的透皮吸收具有促进作用，说明NMP能够改变三七素在皮肤溶解性，促进药物在角质层的通透性。通过Higuchi方程拟合，r为0.990 4。5% NMP的Q达到0.637 mg/cm²，与对照组0.338 mg/cm²相比，增加了近1倍，P_m为0.131 cm/h^1/2、J为0.187 mg∙cm⁻²∙h^−1/2。