2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港 222001;
3. 中药提取精制新技术重点研究室, 江苏 连云港 222001
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. The Key Laboratory for the New Technique Research of TCM Extraction and Purification, Lianyungang 222001, China
山银花为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属Lonicera Linn. 植物华南忍冬Lonice confusa (Sweet) DC. 的干燥花蕾,具有清热解毒之功效,药用历史悠久[1]。临床上山银花主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等症[2];主要有挥发油类、黄酮类、有机酸类、苷类等化学成分[3]。本实验通过对山银花提取物进行系统化学成分研究,分离得到10个化合物,分别鉴定为绿原酸(chlorogenic acid,1)、槲皮素(quercetin,2)、木犀草素(luteolin,3)、木犀草素-3′-O-α-L-鼠李糖苷(luteolin-3′-O-α-L-rhamnopyranoside,4)、芹菜素-7-O-α-L-鼠李糖苷(apigenin-7-O-α-L- rhamnopyranoside,5)、反式桂皮酸(trans-cinnamic acid,6)、对羟基苯甲醛(p-hydroxy benzaldehyde,7)、2,5-二羟基苯甲酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(gentisic acid-5-O-β-D-glucopyranoside,8)、苄基-β-D-吡喃葡萄糖苷(benzyl-β-D-glucoside,9)、脱落酸(abscisic acid,10)。其中化合物4~10首次从山银花中分离得到。
1 材料与仪器Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司),配自动进样器、四元泵、MWD检测器,制备柱(美国Agilent公司,250 mm×21.2 mm,7 μm);Bruker-AV-400型核磁共振光谱仪;AE240电子分析天平(瑞士 Mettler公司)。MULTISKAN MK3型酶标仪(Thermo Scientific,美国);Agilent 1290-6538液质联用仪(美国Agilent公司);XT5显微熔点测定仪(北京科仪电光仪器厂);2051型紫外-可见光分光光度仪;Sephadex LH-20(Pharmacia公司);柱色谱硅胶(200~300目,青岛海洋化工);甲醇、乙腈(色谱纯,Oceanpak公司,瑞典);甲酸(分析纯,南京化学试剂有限公司);95%乙醇(食用级,连云港长和酒业有限公司);水(三蒸水,自制);分析纯试剂(南京化学试剂有限公司)。
山银花药材于2013年5月购自安徽亳州(产地湖南溆浦),经南京中医药大学吴启南教授鉴定为忍冬科植物华南忍冬Lonicera confuse (Sweet) DC. 的干燥花蕾,标本(20130506)保存于江苏康缘药业股份有限公司标本室。
2 提取与分离取山银花10.0 kg,以8倍量70%乙醇回流提取3次,每次2 h,提取液浓缩,得流浸膏7 L,将其混悬于水中,依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,分别得到石油醚部位(146 g)、醋酸乙酯部位(268 g)、正丁醇部位(234 g)。醋酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)进行梯度洗脱,经TLC检识合并得到10个部分(Fr. 1~10)。Fr. 2经反复硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇(100∶1→8∶1)梯度洗脱,再经Sephadex LH-20柱色谱,以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱纯化,得到化合物1(20 mg)、2(16 mg)、3(13 mg)。
Fr. 9经反复硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶100)梯度洗脱,得到8个部分Fr. 9-1~9-8,Fr. 9-5经反复硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇(18∶1)洗脱,再经HPLC制备液相纯化,以17%乙腈作为流动相,体积流量20 mL/min,进样量600 μL,柱温为室温,检测波长210、230、326 nm得到化合物9(10 mg);Fr. 9-7经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,再经HPLC制备液相纯化,以15%乙腈作为流动相,体积流量20 mL/min,进样量500 μL,柱温为室温,检测波长210、230、326 nm得到化合物10(5 mg)。
Fr. 10经反复硅胶柱色谱,二氯甲烷-甲醇(100∶1→0∶100)梯度洗脱,得到8个部分Fr. 10-1~10-8。Fr. 10-2经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,再经HPLC制备液相纯化,以20%乙腈作为流动相,体积流量20 mL/min,进样量500 μL,柱温为室温,检测波长210、230、326 nm得到化合物6(9 mg)、8(6 mg);Fr. 10-5经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱,再经HPLC制备液相纯化,以18%乙腈作为流动相,体积流量20 mL/min,进样量500 μL,柱温为室温,检测波长210、230、326 nm得到化合物4(10 mg)、5(6 mg)、7(5 mg)。
3 结构鉴定化合物1:白色粉末,mp 207~209 ℃,ESI-MS m/z: 353 [M—H]-,1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 7.55 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-7′),7.04 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-2′),6.96 (1H,dd,J = 8.4,2.0 Hz,H-6′),6.77 (1H,d,J = 8.4 Hz,H-5′),6.25 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-8′),5.32 (1H,m,H-3),4.15 (1H,m,H-5),3.72 (1H,dd,J = 8.4,3.2 Hz,H-4),2.23~2.04 (4H,m,H-2,6);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ: 177.8 (COOH),169.4 (C-9′),150.4 (C-4′),147.9 (C-7′),147.6 (C-3′),128.6 (C-1′),123.8 (C-6′),117.2 (C-5′,8′),116.0 (C-2′),76.9 (C-1),74.3 (C-4),72.8 (C-5),72.1 (C-3),39.6 (C-2),39.0 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[4],故鉴定化合物1为绿原酸。
化合物2:黄色粉末,mp 315~316 ℃,ESI-MS m/z: 303 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 6.30 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-6),6.51 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-8),6.99 (1H,d,J = 8.1 Hz,H-5′),7.67 (1H,dd,J = 8.1,2.4 Hz,H-6′),7.81 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-2′),9.39 (1H,s,3-OH),10.78 (1H,s,7-OH),12.15 (1H,s,5-OH);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ: 94.4 (C-8),99.1 (C-6),104.1 (C-10),115.8 (C-2′),116.2 (C-5′),120.9 (C-6′),121.4 (C-1′),136.7 (C-3),162.3 (C-9),145.7 (C-3′),146.9 (C-2),148.3 (C-4′),157.7 (C-7),176.5 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[5],故鉴定化合物2为槲皮素。
化合物3:黄色粉末,mp 328~330 ℃,ESI-MS m/z: 287 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 6.20 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-6),6.45 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-8),6.69 (1H,s,H-3),6.91 (1H,d,J = 8.4 Hz,H-5′),7.44 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-2′),7.53 (1H,dd,J = 8.4,2.0 Hz,H-6′),9.63,9.94,10.80,12.99 (4H,s,4×-OH);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ: 94.0 (C-6),99.0 (C-8),103.0 (C-3),103.9 (C-10),113.6 (C-5′),116.2 (C-2′),119.2 (C-6′),121.7 (C-1′),145.9 (C-2),157.5 (C-3′),161.7 (C-5),164.1 (C-9),181.8 (C-4)。以上数据与文献报道基本一致[6],故鉴定化合物3为木犀草素。
化合物4:黄色粉末。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 13.00 (1H,s,5-OH),10.00 (1H,s,7-OH),9.44 (1H,s,4′-OH),7.43 (1H,dd,J = 1.8,7.8 Hz,H-6′),7.41 (1H,d,J = 1.8 Hz,H-2′),6.91 (1H,d,J = 7.8 Hz,H-5′),6.76 (1H,s,H-3),6.74 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-8),6.38 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-6),5.13 (1H,d,J = 1.6 Hz,H-1″),3.20~3.79 (4H,m,H-2″~H-5″),1.20 (1H,d,J = 6.6 Hz,H-6″)。以上数据与文献报道基本一致[7],故鉴定化合物4为木犀草素-3′- O-α-L-鼠李糖苷。
化合物5:淡黄色粉末。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 12.98 (1H,s,5-OH),7.92 (2H,d,J = 8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.92 (2H,d,J = 8.4 Hz,H-3′,5′),6.85 (1H,s,H-3),6.83 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-8),6.52 (1H,d,J = 2.4 Hz,H-6),5.02 (1H,d,J = 2.5 Hz,H-1″),3.75 (1H,m,H-5″),3.48 (2H,m,H-3″,H-4″),3.20 (1H,m,H-2″),1.19 (3H,d,J = 6.0 Hz,H-6″);13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ: 182.1 (C-4),163.5 (C-2),162.9 (C-7),161.3 (C-5,4′),156.6 (C-9),128.5 (C-2′,6′),121.3 (C-1′),116.1 (C-3′,5′),103.7 (C-10),102.9 (C-3),100.7 (C-6),94.9 (C-8),100.7 (C-1″),71.7 (C-2″),70.7 (C-3″),72.1 (C-4″),68.2 (C-5″),17.6 (C-6″)。以上数据与文献报道基本一致[8],故鉴定化合物5为芹菜素-7-O-α-L-鼠李糖苷。
化合物6:无色针晶(甲醇),mp 133~135 ℃,ESI-MS m/z 147 [M-H]–。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.80 (1H,d,J = 15.9 Hz,H-7),7.56 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-2,6),7.43 (3H,m,H-3~5),6.48 (1H,d,J = 15.9 Hz,H-8);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ: 172.1 (C=O),147.1 (C-3),134.1 (C-1′),130.7 (C-4′),128.9 (C-2′,6′),128.3 (C-3′,5′),117.1 (C-2)。以上数据与文献报道基本一致[9],故鉴定化合物6为反式桂皮酸。
化合物7:白色针晶(丙酮),mp 105~106 ℃,ESI-MS m/z: 121 [M-H]–。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 9.75 (1H,s,H-7),7.75 (2H,d,J = 8.0 Hz,H-2,6),6.86 (2H,d,J = 8.0 Hz,H-3,5);13C-NMR (CD3OD,100 MHz) δ: 193.1 (C-7),165.4 (C-4),133.7 (C-2,6),130.6 (C-1),117.6 (C-3,5)。由以上数据与文献报道一致[10],故鉴定化合物7为对羟基苯甲醛。
化合物8:无色胶状物。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.53 (1H,d,J = 3.0 Hz,H-6),7.04 (1H,dd,J = 3.0,8.4 Hz,H-4),6.67 (1H,d,J = 8.4 Hz,H-3),4.71 (1H,d,J = 7.2 Hz,H-1′),3.84 (1H,d,J = 12.0 Hz,H-6′a),3.67 (1H,dd,J = 3.6,12.0 Hz,H-6′b),3.35~3.41 (4H,m,H-2′~5′);13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 175.7 (C-7),158.0 (C-5),150.9 (C-2),123.8 (C-4),120.2 (C-1),119.6 (C-6),117.5 (C-3),103.7 (C-1′),75.0 (C-2′),78.0 (C-3′),71.3 (C-4′),77.9 (C-5′),62.5 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[11],故鉴定化合物8为2,5-二羟基苯甲酸- 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物9:白色无定形粉末;ESI-MS m/z: 293 [M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CD3OD) δ: 7.32 (2H,d,J = 7.5 Hz,H-2,6),7.23 (2H,t,J = 7.5 Hz,H-3,5),7.17 (1H,t,J = 7.5 Hz,H-4),4.83 (1H,d,J = 11.5 Hz,H-7a),4.57 (1H,d,J = 11.5 Hz,H-7b),4.26 (1H,d,J = 8.0 Hz,H-1′),3.80 (1H,dd,J = 2.0,11.5 Hz,H-6′a),3.59 (1H,dd,J = 5.5,11.5 Hz,H-6′b),3.27~3.14 (5H,m,H-2′~5′);13C-NMR (100 MHz,CD3OD) δ: 137.9 (C-1),128.1 (C-2,6),128.0 (C-3,5),127.5 (C-4),102.1 (C-1′),76.9 (C-5′),76.9 (C-3′),74.0 (C-2′),70.6 (C-7),70.5 (C-4′),61.6 (C-6′)。以上数据与文献报道基本一致[12],故鉴定化合物9为苄基-β- D-吡喃葡萄糖苷。
化合物10:白色无定形粉末,ESI-MS m/z: 287 [M+Na]+。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.92 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-4),6.38 (1H,d,J = 16.0 Hz,H-5),5.82 (1H,s,H-8),5.75 (1H,s,H-2),2.54 (1H,d,J = 17.0 Hz,H-10a),2.14 (1H,d,J = 17.0 Hz,H-10b),2.05 (3H,s,15-CH3),1.90 (3H,s,14-CH3),1.07 (3H,s,12-CH3),1.03 (3H,s,13-CH3);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ: 197.2 (C-9),167.1 (C-1),163.1 (C-3),151.0 (C-7),138.3 (C-5),128.6 (C-4),127.3 (C-8),118.6 (C-2),80.0 (C-6),50.3 (C-10),42.2 (C-11),24.7 (C-14),23.5 (C-13),21.2 (C-15),19.1 (C-12)。以上数据与文献报道基本一致[13],故鉴定化合物10为脱落酸。
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