丹参酮（tanshinone）又称总丹参酮，是丹参Salvia miltiorrhiza Bunge中的脂溶性二萜醌类化学成分，包括丹参酮I、丹参酮II_A、丹参酮II_B、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余种化合物。这些化合物在改善冠状动脉供血、抑制血小板聚集、消炎、抑菌及抗肿瘤等方面疗效显著，同时具有抗氧化和提高耐缺氧能力等药理作用^[1,2,3]。丹参酮的独特功效使其成为国际上广泛认可的有效治疗心脑血管疾病的天然药物之一。随着人类生活水平的不断提高和饮食结构的逐渐变化，心脑血管疾病已位居威胁人类健康的重大疾病之首，由此导致对丹参酮的需求量剧增。天然存在的丹参酮主要分布于丹参属植物中，丹参是其主要来源。然而，丹参的资源有限，并且其中丹参酮的量低，造成丹参酮的产量不能满足日益增长的临床需要。研究人员试图通过干预丹参酮生物合成过程达到提高丹参中丹参酮量的目的，因此，对丹参酮的生物合成途径及其关键酶进行了大量的研究。本文对这方面的研究进展进行了总结与展望。 1 生物合成途径

丹参酮属于二萜醌类化合物，而所有的天然萜类化合物都来自2个基本的五碳通用前体，即异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）^[4]。 然而，生物合成却有2条截然不同的途径（图 1），一条是经典的甲羟戊酸（MVA）途径^[5]，另一条为丙酮酸/磷酸甘油醛（DXP）途径^[6]。这2条途径分别在不同的亚细胞区域内进行，MVA途径位于细胞质中，DXP途径位于质体中，并且这2条途径中所涉及的酶和基因也完全不同。但是，这2条途径却通过IPP和DMAPP联系在一起^[7]。表 1中列出了目前发现的这2条途径中关键酶基因的基本信息。

图 1 丹参酮的生物合成途径 Fig. 1 Biosynthesis pathway of tanshinone

表 1(Table 1)

表 1 MVA和DXP途径中关键酶基因的基本信息 Table 1 Basic information of key enzyme genes in MVA and DXP pathways 基因名称 催化步骤 物种来源 简写 Genbank登录号 表达特征/序列分析 AACT 两分子乙酰CoA→ 乙酰乙酰CoA 丹参 SmAACT EF635969 在根、茎、叶中均有表达，以根中的表达量最高，且受生物和非生物诱导子的调控；其cDNA全长1 623 bp，含有1 200 bp开放阅读框，编码399个氨基酸[8] 油茶Camellia oleifera CoAACT GU594059 其cDNA长1 495 bp，包括65 bp的5’非编码区和203 bp的3’非编码区，以及1 227 bp的编码区，编码408个氨基酸残基[9] 罗汉果Siraitia grosvenorii SgAACT HQ128554 其cDNA全长1 580 bp，开放阅读框为1 224 bp[10] HMGS 乙酰乙酰CoA+乙酰 CoA→3-羟基-3-甲基 戊二酰CoA 丹参 SmHMGS DQ243700 在根、茎、叶中均有表达，以叶中表达最高，根中最低[11] 茶树Camellia sinensis CsHMGS JQ390224 在成熟叶片中表达量高于幼嫩叶片中；全长1 829 bp，开放阅读框1 401 bp，编码467个氨基酸残基[12] 喜树Camptotheca acuminata CaHMGS ACD87446 在子叶和胚轴中的表达量很高，根中几乎不表达，且其表达受水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导调控[13] 罗汉果 SgHMGS HQ128555 其cDNA全长1 889 bp，开放阅读框为1 389 bp[10] HMGR 3-羟基-3-甲基戊二酰 CoA→甲羟戊酸 丹参 smHMGR EU680958 组成型表达基因，根中表达最强，茎中次之，叶中最弱，水杨酸和茉莉酸甲酯能够上调其表达；其cDNA全长为2 115 bp，包含1 695 bp的开放阅读框，编码565个氨基酸残基[14] 杜仲Eucommia ulmoides EuHMGR AY796343 在叶子和幼果中均有表达，但其调控机制极其复杂[15] 乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis GuHMGR GQ845405 其cDNA全长1 849 bp，含有1 722 bp开放阅读框，编码含573个氨基酸残基的蛋白质[16] 秦艽Gentiana macrophylla GmHMGR1、 GmHMGR2 JQ995754、 JQ995755 主要在根和花中表达；包含完整的开放阅读框，编码蛋白含有HMGR蛋白特有的4个保守活性位点[17] 马铃薯Solanum tuberosum HMGR-c2 AF096838 在根、茎、叶等组织中均有表达，且在叶中的表达量约为根、茎中的2倍[18] 罗汉果 SgHMGR HQ128556 其cDNA全长1 926 bp，开放阅读框为1 749 bp[10] DXS 3-磷酸甘油醛＋丙酮酸→ 1-脱氧-D-木酮糖磷酸 丹参 SmDXS1 EU670744 组成型表达基因，在叶中表达最强，茎中稍弱，根中最弱[11] 丹参 SmDXS2 FJ643618 非组成型基因，只在根部表达，在茎和叶中检测不到其表达[11] 高良姜Alpinia officinarum AoDXS1 HQ874656 开放阅读框为2 148 bp，编码的蛋白含有715个氨基酸残基[19] 高良姜 AoDXS2 HQ874657 开放阅读框为2 136 bp，编码的蛋白含有711个氨基酸残基[19] CMK 4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇→ 4-(5-焦磷酸胞苷)-2- C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸 丹参 SmCMK EF534309 其表达受茉莉酸甲酯的调控[20] 巴西橡胶树Hevea brasiliensis HbCMK FJ217703 全长为1 415 bp，编码388个氨基酸残基；其表达具有组织差异性，在愈伤组织中大量表达，在叶片和胶乳中微量表达，乙烯诱导胶乳HbCMK的表达，对HbCMK的表达几乎没有影响[21] MCS 4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸→2-C-甲基赤藓醇- 2,4-环焦磷酸 丹参 SmMCS JX233816 其cDNA全长988 bp，编码234个氨基酸残基；表达受Ag+的诱导[22] 巴西橡胶树 HbMCS1 FJ196164 全长965 bp，编码241个氨基酸残基；其表达具有组织差异性，在愈伤组织中大量表达，在叶片和胶乳中微量表达，割胶诱导胶乳HbMCS1的表达，乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响[23] 黄花蒿Artemisia annua AaMCS KC142157 其cDNA全长994 bp，包含681 bp的开放阅读框，编码226个氨基酸残基，基因全长为2 540 bp，包含3个外显子和2个内含子；在根、茎、叶、花中均有表达，花中表达量较高，根和茎中表达量低[24] HDR 甲基丁烯基-4-磷酸→异戊烯基焦磷酸/二甲烯丙基焦磷酸 丹参 SmHDR JX233817 由1 647个核苷酸组成，编码463个氨基酸残基；受Ag+诱导后其表达水平升高，同时伴随着丹参酮类成分量的增加[25] 银杏Ginkgo biloba GbHDR DQ364231 该基因cDNA全长为1 827 bp，包含1 425 bp的开放阅读框，编码含474个氨基酸残基的蛋白质[26] 巴西橡胶 HbHDR EU881977 全长1 627 bp，编码462个氨基酸；乙烯诱导胶乳HbHDR的表达[27] GGPPS 法尼基焦磷酸→牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 丹参 SmGGPPS FJ643617 其cDNA全长1 234 bp，编码364个氨基酸残基；属于组成型表达基因，在叶片和根中表达较强，在茎中表达较弱；SmGGPPS在丹参叶片中受到水杨酸的诱导，但在丹参根、茎、叶中均不受茉莉酸甲酯的诱导[14] 海南粗榧Cephalotaxus mannii CmGGPPS JX971119 其cDNA全长1 694 bp，包含一个1 182 bp的开放阅读框，编码393个氨基酸残基；用Harpin和茉莉酸甲酯等不同类型的激发子处理发现，GGPPS在诱导后表达量均上升，但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显差异[28] 甘薯Ipomoea batatas IbGGPPS EU570195 其cDNA全长1 368 bp，包含一段长度为1 089 bp的开放性阅读框及一段长度为85 bP的5’非翻译区和194 bp的3’非翻译区；在薯块和嫩叶中表达量最高，在成熟叶片和根中表达量次之，在茎中则检测不到其表达[29] CPS 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸→柯巴基焦磷酸 丹参 SmCPS EU003997 cDNA全长为2 688 bp，包含了一个2 382 bp的开放阅读框，编码793个氨基酸残基[30] 穿心莲Andrographis paniculata ApCPS AJ973129 其cDNA全长2 801 bp，包含2 499 bp的开放阅读框，编码833个氨基酸残基[31]

表 1 MVA和DXP途径中关键酶基因的基本信息 Table 1 Basic information of key enzyme genes in MVA and DXP pathways

这2条途径中关键酶基因的研究结果表明，丹参酮类化合物的生物合成途径主要是DXP代谢途径，同时也受MVA途径的影响。 2 MVA途径及其关键酶 2.1 乙酰CoA酰基转移酶（AACT）

AACT是生物合成萜类化合物MVA途径的起始酶，其作用是将2分子的乙酰CoA缩合生成乙酰乙酰CoA^[32]。崔光红等^[8]利用cDNA微阵列和RACE策略克隆得到了SmAACT基因，其cDNA全长1 623 bp，含有1 200 bp开放阅读框，编码399个氨基酸。通过对其序列进行同源性和系统发育分析，结果表明该基因具有乙酰CoA酰基转移酶的重要结构域。同时，利用实时荧光定量PCR技术对SmAACT基因在丹参植株不同器官内的表达以及在毛状根中的诱导表达进行了分析。结果表明，其在丹参根、茎、叶中均有表达，在根中的表达量最高，并且其表达量受生物和非生物诱导子Ag⁺和酵母菌的诱导，并伴随丹参酮的积累。SmAACT基因单核苷酸多态性分析表明，其在不同的个体中存在着大量的单核苷酸变异位点，且部分位点表现出产地特异性。 2.2 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶（HMGS）

HMGS将乙酰乙酰CoA与乙酰CoA缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）^[33]。王敬^[11]成功地从丹参中克隆出编码该蛋白的基因，命名为SmHMGS，并进行了生物信息学和组织特征表达分析。氨基酸多重序列比对分析显示HMGS在不同物种中表现出高度的保守性，说明其在进化过程中是相对稳定的。组织特征表达分析结果表明SmHMGS为组成型表达基因，在叶中表达最高，茎中稍低，根中最弱。随后还考察了不同诱导子对SmHMGS基因表达的影响，结果表明茉莉酸甲酯（MJ）和酵母提取物（YE）能够较好地诱导SmHMGS基因的表达，并伴随着丹参酮的积累。 2.3 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）

在HMGR的催化下，HMG-CoA生成MVA。该反应是MVA途径中的限速反应^[34]。廖攀等^[14]在2009年第1次成功地从丹参中克隆出编码该蛋白的基因，命名为SmHMGR。其cDNA全长为2 115 bp，包含1 695 bp的开放阅读框，编码565个氨基酸。氨基酸多重序列比对显示SmHMGR与其他植物的HMGR有较高的同源性，和其他植物的HMGRs一样，包含2个跨膜结构域和催化结构域。进化树分析表明，其与胡黄连HMGR的亲缘关系最近。组织表达谱分析表明，SmHMGR是一个组成型表达的基因，在丹参根中表达最强，在茎中次之，在叶中最弱，水杨酸（SA）和MJ能够上调其表达。同样Dai等^[35]利用RACE技术从丹参中克隆得到了HMGR基因，将其命名为SmHMGR2，其cDNA全长为1 959 bp，开放阅读框长度为1 653 bp，编码550个氨基酸。序列比对分析和进化树分析表明，SmHMGR2与苍术的HMGR同源性最高，组织特征表达分析表明其在叶、茎、根中的表达较强。同时，实验结果表明上调SmHMGR2的表达伴随着丹参酮量的增加。

在甲羟戊酸激酶（MK）及磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）催化的连续2步磷酸化步骤中，MVA生成5-焦磷酸甲羟戊酸（MD），随后，MD在5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（MDD）催化作用下脱羧生成IPP^[36,37]。 3 DXP途径及其关键酶 3.1 脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）

该途径最初的前体物质是3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸（PA），二者在DXS催化作用下生成1-脱氧-D-木酮糖磷酸（DOXP），DXS所催化的反应是该途径中的第1步限速反应^[38,39]。王敬^[11]成功地克隆出了丹参的2个DXS成员，分别命名为SmDXS1和SmDXS2，并且表明SmDXS1是组成型表达的基因，在叶中表达最强，茎中稍弱，根中最弱。SmDXS2基因不是组成型基因，只在根部表达，在茎和叶中检测不到其表达。 3.2 DXP还原异构酶（DXR）

在DXR作用下，DXP经原子重排和还原生成2-C-甲基-D-赤藓醇-4-D-磷酸（MEP），DXR是DXP途径中的第2步催化酶，也是DXP途径重要的限速酶^[40]。Yan等^[41]从丹参中克隆得到了SmDXR基因，通过生物信息学分析证明其与其他植物具有很高的同源性，进化树分析表明其和番茄的亲缘关系较近，在根、茎、叶中均有表达，属于组成型基因。通过诱导子分析表明，其在叶片中能够被SA所诱导，而在根、茎、叶中则被MJ所阻遏。Wu等^[42]利用DXR功能缺陷的大肠杆菌菌株互补实验鉴定了SmDXR蛋白的酶活性，并首次报道在渗透压和YE处理后，SmDXR转录水平表达量提高的同时，丹参酮量也提高，暗示SmDXR可能参与控制代谢流流动，并且可能是丹参酮生物合成代谢调控的靶点。 3.3 CMK、MCS、HDR

在2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（MCT）作用下，MEP和5-焦磷酸胞苷（CDP）缩合生成4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇（CDP-ME）^[43]，然后，CDP-ME在4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶（CMK）催化作用下磷酸化生成4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸（CDP-MEP）^[44]。接下来，在2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶（MCS）作用下，CDP-MEP转化为2-C-甲基赤藓醇-2,4-环焦磷酸（ME-cPP）^[45]。在上述3步酶促反应中，王学勇等^[20]从丹参毛状根中克隆得到了中间一步反应的CMK酶基因（命名为SmCMK），并且初步证明了SmCMK基因表达量与丹参酮类成分积累之间的关系。高伟等^[22]采用RACE法克隆得到了SmMCS基因，其cDNA全长988 bp，编码234个氨基酸，并且，其表达受Ag⁺的诱导。之后，ME-cPP在羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶（HDS）催化作用下生成羟甲基丁烯基-4-磷酸（HMBPP）^[46]，最后HMBPP在1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）催化下转化为IPP和DMAPP^[47]。程琪庆等^[25]成功地从丹参中克隆得到了SmHDR基因，其由1 647个核苷酸组成，编码463个氨基酸，序列比对和系统进化分析表明SmHDR与其他植物的HDR家族具有较高的同源性，和库洛胡黄连HDR的亲缘关系较近。并且，受Ag⁺诱导后其表达水平升高，同时伴随着丹参酮类成分量的增加，说明其可能参与丹参酮的生物合成。而后，IPP和DMAPP在IPP异构酶（IPPI）的作用下相互转化，实现了MVA途径和DXP途径之间的交流。 4 下游途径及关键酶 4.1 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化酶（GGPPS）

GGPPS催化法尼基焦磷酸（FPP）生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），而GGPP是多种初级和次级代谢产物的共同前体，因此GGPPS成为丹参酮代谢途径中的关键酶。廖攀^[14]成功地克隆出SmGGPPS基因，其cDNA全长1 234 bp，编码364个氨基酸。氨基酸多重序列比对显示SmGGPPS与其他植物的GGPPS有较高的同源性。进化树分析表明其与其他GGPPS蛋白都来自同一祖先，组织特异性分析表明SmGGPPS是一个组成型表达的基因，在叶片和根中表达较强，在茎中表达较弱。SmGGPPS在丹参叶片中受到SA的诱导，但在丹参根、茎、叶中均不受MJ的诱导。张蕾等^[48]对二萜类物质代谢途径中的共同前体合酶GGPPS进行了研究，克隆得到一条cDNA序列，其全长1 298 bp，开放阅读框为1 095 bp，编码364个氨基酸，包含一段由52个氨基酸组成的质体定位信号肽。同时对其组织表达特异性进行了分析，结果表明该基因为组成型表达的基因，在根、茎、叶等多个组织的多个时期中均有表达，尤以花期叶片的表达最强。 4.2 柯巴基焦磷酸合酶（CPS）和类贝壳杉烯合酶（KSL）

CPS、KSL是丹参酮GGPP下游生物合成途径的2个关键酶基因。高伟等^[30]从丹参中克隆得到了SmCPS和SmKSL。SmCPS的cDNA全长为2 688 bp，包含了一个2 382 bp的开放阅读框，编码793个氨基酸，氨基酸序列N端含有“DXDD”基序的结构功能域，推测其具有起始环化GGPP的功能。通过对SmCPS的mRNA表达进行分析，证明了该基因参与了丹参酮类成分的生物合成。通过对SmCPS基因的表达条件进行优化，制备了SmCPS的多克隆抗体^[30]。SmKSL的cDNA全长共2 110 bp，包含了一个1 788 bp的开放阅读框，编码595个氨基酸，其氨基酸序列C端含有“DDXXD”基序的结构域，推测其具有磷酸离子化底物的功能，其mRNA表达分析结果说明该基因参与丹参酮类成分的生物合成。Cheng等^[49]利用实时荧光定量PCR技术考察了诱导子对SmCPS基因表达的影响，实验结果表明，诱导子能够显著提高SmCPS的表达。该作者同时还考察了诱导子对丹参酮量的影响，发现YE＋Ag⁺，Ag⁺＋MJ和YE＋Ag⁺＋MJ诱导子的组合能够提高毛状根中隐丹参酮和二氢丹参酮的量。 5 展望

丹参酮是目前国际上广泛认可的治疗心脑血管疾病的有效天然药物之一，而心脑血管疾病是人类健康的“头号杀手”，因此，丹参酮的市场需求量很大。由于丹参酮药源匮乏问题使其临床应用受限。丹参毛状根的培养被认为是获得丹参有效成分的重要途径，且这方面的研究也较成熟^[50]。然而丹参毛状根中有用的次生代谢产物量较低等原因阻碍了利用丹参毛状根培养生产丹参酮等有用次生代谢产物的工业化。通过基因工程技术，改造并克隆丹参酮生物合成途径中的关键酶基因并将其导入丹参植株内，获得高产丹参酮的丹参毛状根或再生植株，并对其进行大规模培养是进一步提高丹参酮产量的前提和基础。目前的研究局限在基于同源性的丹参酮生物合成途径中关键酶基因的克隆、生物学信息和表达特征分析等方面。这些只能从序列上表明其与已知的其他物种的具催化功能的基因同源，并推测其活性，但若要确定其功能，需要进行蛋白表达纯化后的酶活研究。因此，对改造后的基因进行表达谱分析和酶活分析，寻找适合的载体以获得高产、稳定的再生丹参植株是今后研究者需要克服的难题和努力的方向。