泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep. 的干燥块茎。其性寒，味甘、淡，入肾、膀胱经，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂的功效^[1]。关于泽泻质量标准的研究，《中国药典》2010年版首次增加了定量测定项目，将23-乙酰泽泻醇B作为指标成分。对照品的制备，传统方法是采用有机溶剂回流提取结合常压柱色谱方法^{[2, 3]}或中压柱色谱方法^[4]制备，近年开始有较多学者^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}采用高速逆流色谱（HSCCC）法快速分离纯化天然药物的活性成分，还有将超临界流体萃取技术与HSCCC技术结合起来分离纯化的报道^{[11, 12, 13]}。关于超临界CO₂萃取技术在中药泽泻提取中的应用也有相关文献报道^{[14, 15]}。本研究以泽泻为原料，应用超临界流体萃取技术结合HSCCC技术，从泽泻中快速制备23-乙酰泽泻醇B，旨在为闽产中药泽泻化学对照品高效提取纯化与工业化制备提供参考。

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泽泻采自福建省建瓯市吉阳镇泽泻药材GAP基地，经福建省建瓯市吉阳镇农技站站长葛培盛鉴定为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep. 的干燥块茎；23-乙酰泽泻醇B对照品购自中国食品药品鉴定研究院（批号111846-201102，质量分数98.5%），甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇等试剂均为国产分析纯。

将泽泻切片后，60 ℃烘箱干燥，再粉碎成粗粉备用。称取泽泻粗粉3 194.8 g，装入超临界CO₂流体萃取装置10 L萃取釜，旋紧萃取釜和分离釜的顶盖，旋紧出料阀，接通总电源，设定所需压力温度40 ℃，打开制冷系统，CO₂钢瓶，打开压缩机对系统进行增压，当压力达到设定压力35 MPa时，连通整个系统，开始进行萃取，并随时监控压力变化，必要时进行调节，萃取满2 h后，停掉压缩机、制冷系统，打开放料阀放料，放空系统压力，打开萃取釜，取出萃余物，经干燥称质量得127.5 g浸膏，该步骤制备的泽泻超临界CO₂萃取物得率为4.0%。

色谱柱为Lnertsil^® ODS-sp-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（80∶20）；检测器为DAD（二极管阵列检测器）；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长208 nm。23-乙酰泽泻醇B对照品与泽泻超临界CO₂萃取物的液相色谱图见图 1，峰面积归一化法显示泽泻超临界CO₂流体萃取物中23-乙酰泽泻醇B峰面积占34.81%。

图 1 23-乙酰泽泻醇B对照品 (A) 和泽泻超临界CO2Fig. 1 HPLCof 23-acetate alisol B (A) and SFE-CO2

溶剂系统是考察逆流色谱分离效果的重要指标，同时也是HSCCC分离工作的难点。对于HSCCC来说，溶剂系统中两相溶剂的分配系数（K）值的最佳范围为0.5≤K≤1^[16]，可以通过测定K值来选

择合适的HSCCC溶剂系统。首先参考文献报道^[10]找到与23-乙酰泽泻醇B结构接近的化合物的分离溶剂系统，然后按比例配制好不同溶剂，加入泽泻超临界CO₂萃取物适量，超声溶解，静置分层后，分取上下相，挥去溶剂，加入等量乙腈溶解，用0.45 μm滤膜滤过后，用HPLC检测上下相中23-乙酰泽泻醇B的峰面积（A），则K＝A_上/A_下。尝试了6个不同溶剂系统，测得的K值见表 1。结果表明，系统5的分离效果最佳，因此确定正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（3∶2∶3∶2）作为本次HSCCC分离的溶剂系统。

表 1(Table 1)

表 1 不同溶剂体系的K值 Table 1 values of components in different solvent systems 编号 溶剂系统 K 1 氯仿-甲醇-水（4∶3∶2） 50.47 2 氯仿-甲醇-水（5∶3∶2） 31.47 3 氯仿-甲醇-水（6∶3∶1） 12.58 4 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（1∶2∶1∶2） 0 5 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（3∶2∶3∶2） 1.07 6 正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水（4∶2∶4∶2） 0.43

表 1 不同溶剂体系的K值 Table 1 values of components in different solvent systems

将溶剂系统正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水按3∶2∶3∶2配制于分液漏斗中，剧烈振荡15 min后，静置30 min，待体系平衡后分离出上、下相，上相作固定相，下相作流动相，超声脱气30 min，备用。精密称取泽泻萃取物200 mg，超声溶解于10 mL下相中，配制成20 mg/mL上样溶液，仪器转速为800 r/min，流动相体积流量为2.0 mL/min，紫外检测器检测波长为254 nm。根据紫外吸收色谱图手动收集各组分，按时间进行标记，具体出峰情况见图 2。

图 2 泽泻超临界萃取物HSCCC分离图Fig. 2 HSCCC of SFE-CO2extractfromA. orientalis

根据逆流色谱图的峰型、峰位，对收集的组分进行了归属并处理，并对图 2中8个主要的色谱峰组分、泽泻超临界萃取物原液与对照品溶液进行了液相色谱分析比对，确定图 2中的7号峰为23-乙酰泽泻醇B，7号峰附近（200～250 min）收集的流分液相色谱图见图 3，面积归一化法显示23-乙酰泽泻醇B峰面积占82.7%，有1个较大的杂峰，需要重结晶去除。

图 3 逆流色谱分离图中7号峰组分HPLC图Fig. 3 HPLCof components of peak No. 7 in HSCCC

由于1次逆流色谱分离得到的23-乙酰泽泻醇B流分中尚有其他杂质，故需要进行结晶精制。将7号峰附近收集的溶液，挥去部分溶剂后，在4 ℃冰箱中放置一段时间，可见无色棱状、针状结晶析出，取该结晶适量，用1 mL乙腈溶解后进行液相色谱纯度分析，面积归一化法显示，23-乙酰泽泻醇B峰面积占99.8%，见图 4。用离心方法收集结晶，干燥称定质量得20.0 mg结晶，计算精制工艺对照品的得率为10.0%，总的提取分离纯化干燥得率为0.4%。

图 4 所得结晶的HPLC色谱图Fig. 4 HPLC of obtained crystal

将所得晶体进行理化性质及紫外光谱、红外光谱、质谱及核磁共振氢谱、碳谱鉴定，结果显示本品为无色针晶，mp 183 ℃；EI-MS m/z: 515 [M＋H]⁺, IR ν_max (cm⁻¹): 3 474 (OH), 1 744 (COO), 1 705 (CO)；¹H-NMR (600 Mz, CDCl₃)δ: 1.72 (1H, d, J =10.8 Hz, H-9α), 3.78 (1H, td, J = 10.8, 5.6 Hz, H-11α), 1.06 (3H, d, J =6.8Hz, 21-CH₃), 4.57 (1H, td, J = 8.8, 2.4 Hz, 23-H), 2.76 (1H, d, J =8.8 Hz, 24-H), 2.07 (3H, s, CH₃CO)；¹³C-NMR (150 Mz, CDCl₃) δ: 220.6 (C-3), 170.3 (CH₃CO), 138.3 (C-13), 134.3 (C-17), 71.7 (C-23), 70.5 (C-11), 65.3 (C-24), 58.7 (C-25), 57.2 (C-14), 50.1 (C-9), 48.6 (C-5), 47.2 (C-4), 40.9 (C-8), 37.1 (C-10), 36.9 (C-2), 34.7 (C-12), 34.4 (C-7), 33.9 (C-22), 31.1 (C-1), 30.8 (C-15), 29.8 (C-28), 29.3 (C-16), 28.0 (C-20), 25.9 (C-19), 24.9 (C-27), 24.0 (C-27), 23.4 (C-30), 21.4 (CH₃CO)，检测结果表明，与文献报道的23-乙酰泽泻醇B数据一致^[2]，进一步确定所得晶体为高纯度的23-乙酰泽泻醇B。

超临界CO₂流体萃取法一般在低温条件下进行，且萃取时间短，在此条件下，活性成分不易破坏，而且还有提取收率高、无溶剂残留等优点。SFE-CO₂对小分子、低极性、亲脂性、低沸点的成分如挥发油、烃、酯、内酯、醚、环氧化合物等表现出优异的溶解性，本实验药材泽泻中的23-乙酰泽泻醇B为亲脂性的物质，非常适合采用超临界CO₂流体萃取。实验最后优化确定正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水按3∶2∶3∶2配制溶剂系统最为理想。本方法简捷、快速、高效，所得产物纯度高且费用较低，适合于泽泻对照品的快速制备。