党参为桔梗科党参属党参Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf、素花党参C. pilosula Nannf. var. modesta (Nannf.) L. T. Shen或川党参C. tangshen Oliv. 的干燥根，性平、味甘，具有补中益气、健脾益肺之功效^[1]。党参产地众多，种类各异，主产于山西、甘肃、陕西、四川、湖北等省，主要为栽培品，少量为野生。目前我国党参资源破坏严重，野生资源逐渐变得稀少，急需对药源进行保护^[2]。利用分子标记对其遗传学背景进行研究，研究结果可对制定合理有效的保护策略提供科学依据。

目前尚缺乏党参遗传和基因组信息研究，遗传多样性研究和分子标记研究也只有张建清等^[3]利用RAPD分析甘肃栽培的党参和素花党参在居群水平上的遗传多样性；李忠虎等^[4]利用g-SSR技术分析发现党参野外居群具有较丰富的遗传多样性水平，并且筛选出5对g-SSR引物能够在党参4个近缘物种成功扩增；赵莎等^[5]曾采用党参药材中提取的ITS/ITS2序列对党参药材及其混淆品进行鉴定，但不能成功鉴别党参3个基原物种；He等^[6]利用ITS/ITS2序列分析从甘肃和重庆搜集的65个党参样本，成功鉴别党参3个基原物种；苏强等^[7]初步建立党参AFLP分析体系。目前还缺乏能够大量应用于党参种质鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等研究的简便、高效、稳定且具有种属特异性的分子标记体系。

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）又称微卫星DNA，SSR标记是较为理想的遗传标记，具有数量丰富、分布广泛、多态性强和共显性遗传易于分析等特点^[8]。SSR按来源分，有基因组SSR（g-SSR）和转录组来源的SSR（EST-SSR），相对于g-SSR，EST-SSR标记无需构建基因组文库、杂交、测序，避免了大量人力、物力和时间的投入，同时EST-SSR多态性可能与基因功能直接相关，在相近植物间具有良好通用性^[9]，而且转化率也高。目前药用植物中已有人参^[10]、丹参^[11]、西洋参^[12]和金银花^[13]等借助现有测序数据开发了EST-SSR。研究主要集中于遗传多样性评价、种质鉴定、标记通用性等方面。为此，本研究基于党参转录组文库高通量测序结果，利用MicroSAtellite（MISA）^[14]软件搜索党参SSR位点，分析其分布、组成特征，并进行初步可用性评价，以期为党参遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基因定位和比较作图等研究提供理论基础。

转录组测序样本采自于山西省晋城市陵川县党参GAP基地，原植物由山西医科大学药学院高建平教授鉴定为党参Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf。党参转录组数据来自于课题组前期利用Illumina高通量测序平台对党参进行的全转录组测序，共有45 511条Unigenes。

为了检测党参中的SSR位点，使用软件MISA^[14]对组装得到的Unigene序列进行SSR分析。所检测SSR位点包括单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复和六核苷酸重复6类。判断标准为单核苷酸重复至少12次；二核苷酸重复至少6次；三核苷酸重复、四核苷酸重复至少5次；五核苷酸重复和六核苷酸重复至少4次。

使用软件Primer3对SSR重复单元前后的序列设计引物，每条SSR产生5条引物。主要的引物设置参数如下：扩增产物长度80～300 nt，引物序列长度18～28 nt（最适宜长度为23 nt），退火温度为55～65 ℃（最佳退火温度为60 ℃），GC量为40%～65%（最适宜为50%）。

将设计出的引物通过以下方式筛选：（1）引物不能存在SSR；（2）将获得的引物比对到Unigene序列，引物的5’端允许有3个碱基的错配，3’端允许有1个碱基的错配；（3）去掉比对到不同Unigene上的引物，筛选唯一匹配的引物；（4）使用SSRFinder校验SSR，使用产物序列来寻找SSR，检验结果是否与MISA结果相同，并筛选出相同的SSR产物。

利用软件MISA对党参转录组中的45 511条Unigenes的cDNA序列进行搜索。结果显示，7 327个SSR分布于6 017条Unigenes序列中，SSR发生频率（含有SSR的Unigene数目与总Unigene的数目之比）为12.22%，出现频率（检出SSR个数与总Unigene数目之比）为16.10%。平均每4 520 bp就含有1个SSR位点（表 1）。其中5 006条Unigenes只包含单个SSR位点，1 011条Unigenes包含2～4个SSR位点。

表1(Table 1)

表 1 党参EST-SSR不同重复基元分布情况 Table 1 Distribution of different repeat motifs in C. pilosula transcriptome 重复类型 SSR数 占总SSR比例 / % 发生频率 / % 平均长度 / bp 总长度 / bp 平均距离 / kb 单核苷酸 1 012 13.81 2.22 15.42 15 601 32.74 二核苷酸 4 299 58.67 9.45 16.03 68 896 7.71 三核苷酸 1 585 21.63 3.48 16.75 26 547 20.91 四核苷酸 71 0.97 0.16 20.85 1 480 466.70 五核苷酸 109 1.49 0.24 20.64 2 250 304.00 六核苷酸 251 3.43 0.55 24.00 6 024 132.01 总计 7 327 100.00 16.10 16.49 120 798 4.52

表 1 党参EST-SSR不同重复基元分布情况 Table 1 Distribution of different repeat motifs in C. pilosula transcriptome

党参EST-SSR重复类型丰富，单核苷酸至六核苷酸重复都可以发现。从SSR位点数量上看，出现最多的为一至三核苷酸重复，占到总SSR位点数量的94.1%。其中二核苷酸重复比例最高，可以占到58.7%；其次为三核苷酸和单核苷酸重复，分别为21.6%和13.8%。四、五、六核苷酸重复类型的数量很少，总计不足6%（表 1）。

党参转录组中SSR位点的序列总长度达到120 798 bp，SSR位点平均长度为16.49 bp，各类型SSR位点的平均长度分别为15.42、16.03、16.75、20.85、20.64、24.00 bp。党参转录组中SSR位点重复次数以6次（1 466）最多，占总SSR的20%；其次为重复次数7、5、10、9和8次，SSR位点个数在706～1 006。统计4～10次重复的SSR位点共有6 101个，占83.2%；11～24次重复的SSR位点共有1 226个，占16.7%（图 1）。

图 1 党参EST-SSR重复次数分布图Fig. 1 Distribution of EST-SSR repeat frequency in C. pilosula transcriptome

在党参转录组7 327个SSR位点中，共发现到415种重复基元，其中一至六核苷酸重复基元分别有2、4、10、18、48和122种（表 2）。以二核苷酸重复基元AG/CT最多，总SSR的43.78%；其次为二核苷酸重复基元AC/GT和单核苷酸重复基元A/T，分别占11.83%和10.65%；二核苷酸重复基元中，以AG/CT、AC/GT和AT/AT出现的数量最多，三者共占二核苷酸SSR的99.88%，CG/CG出现次数最少，仅占到二核苷酸SSR的0.12%。在三核苷酸重复基元中，AAG/CTT出现次数最多占三核苷酸SSR的27.7%；其次是ACC/GGT、ATC/ATG和AGG/CCT，分别为19.62%、14.26%和11.36%。其他四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元类型较多，数量较少，出现频率均较低。

表2(Table 2)

表 2 党参EST-SSR重复基元的类型 Table 2 EST-SSR repeat motifs in C. pilosula transcriptome 重复类型 重复基元 重复个数 发生频率 / % 所占比例 / % 单核苷酸 A/T 780 1.71 10.65 C/G 232 0.51 3.17 二核苷酸 AG/CT 3 208 7.05 43.78 AC/GT 867 1.91 11.83 AT/AT 219 0.48 2.99 CG/CG 5 0.01 0.07 三核苷酸 AAG/CTT 439 0.96 5.99 ACC/GGT 311 0.68 4.24 ATC/ATG 226 0.50 3.08 AGG/CCT 180 0.40 2.46 AGC/CTG 122 0.27 1.67 AAC/GTT 112 0.25 1.53 CCG/CGG 72 0.16 0.98 AAT/ATT 59 0.13 0.81 ACG/CGT 33 0.07 0.45 ACT/AGT 31 0.07 0.42 四核苷酸 AAAG/CTTT 13 0.03 0.18 ACAT/ATGT 12 0.03 0.16 AAAT/ATTT 7 0.02 0.10 AGCC/CTGG 7 0.02 0.10 AAAC/GTTT 5 0.01 0.07 剩余四核苷酸 27 0.06 0.37 五核苷酸 AAAAG/CTTTT 10 0.02 0.14 AAAAT/ATTTT 10 0.02 0.14 AAAAC/GTTTT 8 0.02 0.11 AAGAG/CTCTT 8 0.02 0.11 AAATC/ATTTG 6 0.01 0.08 剩余五核苷酸 67 0.15 0.91 六核苷酸 AAAGAG/CTCTTT 11 0.02 0.15 AAAAAG/CTTTTT 7 0.02 0.10 AAGAGG/CCTCTT 7 0.02 0.10 AAGCCC/CTTGGG 7 0.02 0.10 AAGGAG/CCTTCT 7 0.02 0.10 剩余六核苷酸 212 0.47 2.89

表 2 党参EST-SSR重复基元的类型 Table 2 EST-SSR repeat motifs in C. pilosula transcriptome

SSR分子标记的多态性是判断其可用性的重要依据^[15]。SSR的长度是影响其多态性高低的重要因素，当SSR长度大于或等于20 bp时多态性较高，长度在12～20 bp的SSR多态性中等，而长度在12 bp以下时多态性极低^[16]。党参EST-SSRs的长度在12～25 bp，其中长度在12～20 bp的SSR有6 483条，占SSR总数的88.48%，这类SSR位点具有中等多态性；而长度在20 bp以上的SSR达到844条，占SSR总数的11.52%，这类SSR具有较高多态性。此外，根据Dreisigacker等^[17]的发现，高级基元SSR多态性普遍比低级基元的低。经统计发现，长度在20 bp以上的党参EST-SSR中，包含低级基元一、二、三核苷酸SSR共564条。可以预计这部分多态性潜能高的SSR在党参上应具有较高的利用价值。

为进一步在实验中利用筛选出的党参EST-SSR，本课题组使用Primer3软件对上下游序列均不小于150 bp的EST-SSR设计引物，每条序列产生5对引物，共有1 484条党参EST-SSR序列获得7 420对引物。通过去除不符合条件的引物，并将产物序列利用SSRFinder校验，检验结果是否与MISA结果一致，最终筛选出引物。结果表明，共有848条党参EST-SSR序列成功设计出4 329对引物（表 3），占到党参EST-SSR总数的8.6%。其中20 bp以上EST-SSR序列且包含低级基元一、二、三核苷酸共设计226对引物。

表3(Table 3)

表 3 党参EST-SSR引物序列 Table 3 EST-SSR primer sequences in C. pilosula 重复基元及类型 上游引物 (5’-3’) 下游引物 (5’-3’) 产物长度 / bp TCA (3*5) TAAAGAATCACTTGGGGAGTCTG ATGGACAGAACATTGCAAAACTT 127 AG (2*9) GAGAATTATGACCTTGAGAAGCG GATTCTGCGCTACAATCAAAATC 128 TGA (3*6) ATAAGGACAATACATCCACAGGG CTTCAAGTTCATTCAACTCGTCC 129 AACGAA (6*4) AGGACCCGTTCTTTGATGATATT CAATAGCAATGGCTGACTTATCC 154 GAA (3*5) GCACTTTATGGATATGATGCTCC GTGCTTCTGCTTCATCTCTGTTT 153 AG (2*9) GCGACATGAACTTGAAGAACTTT TGATCTAGTCATTCATGCTCTTCC 135 GAAGGA (6*4) GGTAGAAAAGACCTCCACCCTAA ACCCTTTTCTCTTTCCTTCTCCT 147 TCC (3*5) GGAATTCATCCTTACCATCAACA AAGAAGATCGTCCTAACCTCGTC 149 TCA (3*6) ACTTAGACTGCTCCACTTCATGC GGGTCCTAGAACCAACTTGAGAG 133 GA (2*9) AGTAAGTGGGATGATGAAAAGCA CGATTTCCTCCATTTCCTTCTAT 116 GAG (3*6) TTTTCTAAGGACAGTTGTGGTGG CTTATCATCAGTGCTGACCTGTG 132 TGG (3*5) GGAAGTAGACCAAGAGTGGGAGT TTGATTCTCAAACAAGTGTCACG 132 CAC (3*6) TCATCCATTGCAACCTAATCAGT TTAGAACTAGGAGCTGCACCATT 138 GA (2*10) TCTTGCTTCTCAAAGATACGACC CTAGCAGGTGAAAGCAAACACTA 134

表 3 党参EST-SSR引物序列 Table 3 EST-SSR primer sequences in C. pilosula

党参转录组中共搜索到7 327个SSRs，平均出现频率为1/4 520。与其他药用植物比较，党参SSR出现的频率低于丹参（1/2 100）^[11]，高于人参^[10]（1/5 800）、金银花^[13]（1/7 490）、西洋参^[12]（1/7 500）和杜仲^[18]（1/11 610）；同时与模式植物比较，也高于拟南芥（1/13 830）、大豆（1/7 400）、杨树（1/14 000）和棉花（1/20 000）^[19]等植物，这表明党参转录组中SSR数量很丰富。

根据已有报道，大多数植物的EST-SSRs以三核苷酸和二核苷酸重复类型为主，但主要的重复基元类型有所差异^[15]。研究发现党参EST-SSR以二核苷酸为最多的重复基元，其次是三核苷酸重复，这与人参、丹参以及茶树EST-SSR中的优势重复类型是一致的。从出现的频率来看，各种不同的重复基元出现最多的是AG/CT，其次是AC/GT和A/T。GC重复基元在多数植物中很难见到，但出现频率都极低^[15]。在党参转录组中仅找到5个GC重复，出现频率也极低。此外，党参转录组中长度在20 bp以上的SSR达到844条，占SSR总数的11.52%，并且其中有66.82%是多态性潜能高的低级基元一、二、三核苷酸SSR，这部分SSR可能具有较高的利用价值。

对遗传学背景研究取决于合适的遗传分析工具的选择。而分子标记技术中，RAPD技术重复性差、不稳定；AFLP虽然稳定可靠，但成本高、对DNA质量要求高，实验程序复杂、工作量大；ITS条形码仅可用于药用植物及其易混伪品的鉴定。相比之下SSR标记具有共显性、高度可重复、多态性丰富、对DNA质量要求低、可通过PCR快速检测，是遗传学背景研究非常有效的工具。缺点是SSR标记具有特异性，必须进行PCR检测，存在引物开发问题^[20]。本实验对所获得的党参EST-SSR利用软件设计引物，方法快速、通量大、成本低，并通过筛选共获得4 329对SSR引物，为党参的SSR分析奠定数据基础。

本研究结果表明党参转录组数据是SSR重要来源之一，与基因组SSR相比，EST-SSR反映了基因组的编码区域，可直接获得基因表达的信息，省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有测序数据，降低了开发成本。同时也明确了党参EST-SSR的基本特征，为进一步开发新的党参功能基因SSR标记奠定了基础。党参EST-SSR对于党参功能基因资源的开发利用、遗传资源评价、丰富其分子标记、种质资源改良和比较基因组学研究都具有重要的价值。