竹叶抗氧化物是《食品添加剂使用标准》GB 2760—2011中允许使用的一种天然食品添加剂，因具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、抗菌及保护心脑血管的作用^{[1,2,3,4,5,6,7]}而被广泛应用于食品、医药和化妆品当中，已经受到国内外市场的广泛关注。

竹叶黄酮中主要包括黄酮、内酯和苯酚类物质^[8,9]，其中黄酮类的2种主要成分是荭草苷和异荭草苷^[10]。由于竹叶黄酮中单体的价格极为昂贵，对进一步定性定量研究其生理活性及结构修饰造成了不便。异荭草苷和荭草苷是一对同分异构体。Zhang等^[10]曾使用树脂吸附洗脱，制备型高效液相色谱（PHPLC）分离和结晶3步来分离竹叶黄酮中的4种碳苷黄酮，其中，PHPLC分离选择了较低体积分数的乙腈水梯度洗脱，分离时间较长，且分离纯度不理想（仍需进一步结晶纯化）。本实验考察了甲醇水比例，进行等度洗脱，并做了单因素条件的优化，分离时间大大缩短，且分离所得单体的质量分数和回收率都达到了理想的结果。

Waters^TM 600型制备液相色谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器，六通进样阀，美国Waters公司；Agilent 1200 Series高效液相色谱仪，安捷伦科技公司；核磁共振波谱仪AVANCE III 500 MHz，瑞士Bruker公司；BS124S电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ—2200超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ULUP—I微量分析型超纯水机，成都超纯科技有限公司；R—201旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司。

AB-8树脂，南开大学化工部，颗粒粒径：0.3～1.25 mm；竹叶黄酮，由浙江圣氏生物公司提供，批号20121114，荭草苷和异荭草苷的质量分数分别为3.7%和1.6%；异荭草苷对照品（批号110120）、荭草苷对照品（批号110319），质量分数均＞98%，上海融禾医药科技发展有限公司；乙腈，色谱纯，Promptar有限责任公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

分析条件：采用C₁₈反相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，Sigma），柱温30 ℃，流动相为乙腈-0.3%乙酸水溶液，梯度洗脱条件：0～16 min，11%乙腈；16～18 min，11%～13%乙腈；18～40 min，13%～16%乙腈；40～42 min，16%～18%乙腈；42～60 min，18%～100%乙腈；60～65 min，100%～11%乙腈；进样量为20 μL，体积流量为0.7 mL/min，检测波长为330 nm，运行时间为70 min。

PHPLC条件：使用C₁₈反相半制备色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，SunFire^TM），柱温为20 ℃，甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67），进样体积400 μL，体积流量5 mL/min，检测波长330 nm，运行时间为40 min。

称取50 g的竹叶黄酮（HPLC检测见图 1-a），使用500 mL无水乙醇溶解，真空抽滤除去极性大的多糖类物质，然后将清液旋干，再使用1 L纯水溶解，真空抽滤除去极性小的黄酮内酯类的物质。将处理好的样品用超纯水稀释至4 L（质量浓度约为8 g/L），并调节pH值为5，上样于装好AB-8树脂的常压玻璃柱中（10 cm×60 cm）^[11]，依次使用1.5 BV的0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%乙醇溶液洗脱，收集时每500毫升为1瓶，其中40%乙醇洗脱条件下，得到异荭草苷（质量分数18.0%）和荭草苷（质量分数10.1%）的洗脱液（HPLC检测见图 1-b）。

图 1

Fig. 1

图 1 竹叶黄酮色谱图 (a) 和40%乙醇洗脱后的竹叶黄酮色谱图 (b) Fig. 1 HPLC of original BLF (a) and 40% ethanol fraction of BLF (b)

将“2.2”项所得的洗脱液（质量浓度为4.2 mg/mL），按“2.1”项中的PHPLC条件进行单体分离。分别收集组分1、2，经一步分离即可得到高质量分数的荭草苷和异荭草苷单体，通过减压蒸馏，真空干燥得到产品粉末，竹叶黄酮苷类化合物的PHPLC图见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 PHPLC分离竹叶黄酮的色谱图 Fig. 2 PHPLC of BLF

在柱温15 ℃，体积流量为3 mL/min，上样质量浓度为4.2 mg/mL，上样体积为200 μL的条件下，考察了不同比例的甲醇和水对黄酮苷的分离效果的影响，从相邻峰的分离度和收集馏分的效率综合分析，选取了甲醇-0.3%乙酸水溶液33∶67作为流动相的比例，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 流动相组成对分离的影响 (±s，n=2) Table 1 Effectof composition of mobile phase on separation (±s，n=2) 甲醇-0.3%乙酸 水溶液 分离度 tR / min 荭草苷 异荭草苷 25∶75 ＞2.5 ＞90 ＞90 30∶70 ＞2.5 ＞90 ＞90 33∶67 2.34±0.03 39.01±0.02 43.79±0.02 35∶65 1.95±0.02 33.76±0.01 37.57±0.01 37∶63 1.37±0.01 22.13±0.02 23.89±0.03 40∶60 0.95±0.06 16.89±0.05 17.86±0.04 50∶50 0 4.30±0.02 4.30±0.02

表 1 流动相组成对分离的影响 (±s，n=2) Table 1 Effectof composition of mobile phase on separation (±s，n=2)

在柱温15 ℃，上样浓度为4.2 mg/mL，上样体积为200 μL的条件下，以甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67）作为流动相，由于体积流量超过5 mL/min时，压力超过27.58 kPa，制备柱会渗漏，故本实验只考察了3、5 mL/min对黄酮苷分离效果的影响，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 流动相的体积流量对分离的影响(±s，n=2) Table 2 Effectof current velocity of mobile phase on separation (±s，n=2) 体积流量 / (mL∙min-1) 分离度 tR / min 荭草苷 异荭草苷 3 2.34±0.03 39.01±0.02 43.79±0.02 5 2.29±0.01 26.93±0.02 30.51±0.01

表 2 流动相的体积流量对分离的影响(±s，n=2) Table 2 Effectof current velocity of mobile phase on separation (±s，n=2)

在体积流量为5 mL/min，上样质量浓度为4.2 mg/mL，上样体积为200 μL的条件下，以甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67）作为流动相，考察了不同柱温对黄酮苷分离效果的影响，结果见表 3，本实验选择了20 ℃作为分离的柱温。

表 3(Table 3)

表 3 柱温对分离的影响 (±s，n=2) Table 3 Effectof column temperature on separation(±s，n=2) 温度 / ℃ 分离度 tR / min 异荭草苷 荭草苷 15 2.31±0.01 28.90±0.02 32.16±0.03 20 2.32±0.03 27.27±0.01 30.79±0.06 30 1.38±0.05 25.24±0.06 28.57±0.05

表 3 柱温对分离的影响 (±s，n=2) Table 3 Effectof column temperature on separation(±s，n=2)

在柱温为20 ℃，体积流量为5 mL/min的条件下，以甲醇-0.3%乙酸水溶液（33∶67）作为流动相，考察了不同上样量对分离效果的影响，结果见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 进样量对分离的影响(±s，n=2) Table 4 Effectof loading quantity of sample on separation (±s，n=2) 质量浓度 / (mg∙mL-1) 进样体 积 / μL 分离度 tR / min 荭草苷 异荭草苷 4.2 200 2.58±0.02 26.93±0.03 30.52±0.02 30.7 200 无法分离 30.7 100 无法分离 20.5 200 2.28±0.10 27.78±0.02 32.45±0.01 20.5 300 1.92±0.00 28.11±0.07 33.70±0.08 20.5 400 无法分离 15.3 400 2.73±0.01 27.87±0.05 32.91±0.05

表 4 进样量对分离的影响(±s，n=2) Table 4 Effectof loading quantity of sample on separation (±s，n=2)

用外标法定量，异荭草苷的进样质量浓度为39.3～275.3 μg/mL，荭草苷的进样质量浓度为50.4～402.5 μg/mL时，进样质量浓度（X，μg/mL）与峰面积（Y）呈良好的线性关系。线性回归方程分别为异荭草苷Y＝0.017 7 X＋0.096 1，R²＝0.999 8；荭草苷Y＝0.016 0 X－3.125 4，R²＝0.999 7。

分离得到荭草苷和异荭草苷的HPLC图谱见图 3，荭草苷和异荭草苷的质量分数通过面积归一法计算分别为（93.38±0.33）%，（99.44±0.37）%；回收率通过外标法计算分别为（85.1±3.45）%，（92.7±2.92）%。

图 3

Fig. 3

图 3 组分1 (a) 和组分2 (b) 的检测色谱图 Fig. 3 Aanalytical HPLC of fractions 1 (a) and 2 (b)

组分1（荭草苷）溶液除去溶剂后溶解于氘代DMSO中，做核磁共振分析，与文献报道^[12,13]比对后，氢谱和碳谱核磁数据归属如下。¹³C-NMR (126 MHz,DMSO) δ: 182.45 (C-4),164.46 (C-2),162.20 (C-7),159.93 (C-5),156.97 (C-9),148.43 (C-4′),146.46 (C-3′),122.44 (C-1′),119.44 (C-6′),116.14(C-5′),113.67 (C-2′),109.44 (C-8),104.67 (C-10),102.37 (C-3),98.67 (C-6),83.66 (C-5″),80.65 (C-3″),75.37 (C-l″),73.38 (C-2″),72.91 (C-4″),62.11 (C-6″)；¹H-NMR (500 MHz,DMSO) δ: 13.18 (1H,s,5-OH) 7.54 (1H,dd,J = 2.0,8.4 Hz,H-6′),7.47 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-2′),6.87 (1H,d,J = 8.4 Hz,5′-H),6.65 (1H,s,3-H),6.25 (1H,s,6-H),4.70 (1H,d,J = 9.7 Hz,H-1″),3.72 (1H,d,J = 11.8 Hz,H-6a″),3.46 (1H,d,J = 11.8 Hz,H-6b″),3.17～3.46 (3H,m,H-3″,4″,5″)。

组分2（异荭草苷）溶液除去溶剂后溶解于氘代甲醇中，做核磁共振分析，氢谱和碳谱核磁数据归属如下。¹³C-NMR (126 MHz,CD₃OD) δ: 184.40 (C-4),166.62 (C-2),164.99 (C-7),162.15 (C-5),159.45 (C-9),151.10 (C-4′),147.09 (C-3′),123.47 (C-1′),120.38 (C-6′),116.86 (C-5′),114.23 (C-2′),109.23 (C-6),105.25 (C-10),103.98 (C-3),95.30 (C-8),82.65 (C-5″),80.18 (C-3″),75.38 (C-1″),72.69 (C-4″),71.83 (C-2″),62.89 (C-6″)；¹H-NMR (500 MHz,CD₃OD) δ: 7.36 (1H,dd,J = 2.0,8.4 Hz,H-6′),7.36 (1H,d,J = 2.0 Hz,H-2′),6.90 (1H,d,J = 8.4 Hz,H-5′),6.53 (1H,s,H-3),6.48 (1H,s,H-8),4.64 (1H,d,J = 9.7 Hz,H-1″),3.85 (1H,m,H-2″),3.73 (1H,d,J = 11.8 Hz,H-6a″),3.43 (1H,d,J = 11.8 Hz,H-6b″),3.30～3.31 (3H,m,H-3″,4″,5″)。

与分析色谱比较，PHPLC要求在尽可能短的时间内获得更多的目标产物，属于非线性色谱。目标产物的质量分数、产量、消耗时间和成本等往往是PHPLC的主要考虑因素^[14]。本实验以2种组分的分离度和保留时间作为考察指标来综合评价分离质量和分离效率，分别考察了流动相的比例和体积流量、温度、上样量对色谱分离的影响。

本实验室曾选择乙腈体系分离，分离纯度和分离效率都比较理想（2种单体质量分数都可达到99%），与甲醇体系洗脱比较，荭草苷和异荭草苷在2种体系的出峰时间顺序正好相反，且在甲醇体系中靠近荭草苷的一点杂质（可能为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷）仅旋光性与之不同，故很难分开，而乙腈则有一定的手性拆分能力^[15]，所以乙腈体系可以得到高质量分数的荭草苷。但考虑到乙腈毒性大，选择了甲醇体系作为流动相。

对于半制备色谱，其他色谱条件确定后，进样量是最重要的参数，它直接决定生产量的大小和制备单体的质量分数。实验结果表明，当样品质量浓度达到30 mg/mL，色谱分辨率急剧下降，即使减少上样体积，也不能实现理想的分离，以20 mg/mL作为上样质量浓度，上样体积超过400 μL时，出现峰形不对称，表明上样量已超过等温吸附的线性范围。确定上样量为6 mg后，进一步将上样质量浓度减小为15.3 mg/mL时，可以得到更理想的分离度，最终确定上样质量浓度15.3 mg/mL，上样体积400 μL，单次上样量为6.12 mg。

本实验通过单次PHPLC分离，即可得到异荭草苷和荭草苷单体，整个过程用时短（仅需40 min），毒性低，分离效果较好，可连续进样制备。分离所得的产品异荭草苷的质量分数＞99%，荭草苷的质量分数＞93%，适于新药研发的分析样品。