毛冬青为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属Ilex L.植物毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arm. 的干燥根，是我国南方常用中药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒功效。已有研究表明毛冬青的主要药理作用包括抗动、静脉血栓，扩张外周血管，抑制血小板聚集，调节机体免疫功能等，在血栓闭塞性脉管炎、缺血性脑血管病、冠心病、心绞痛、心肌梗死、周围血管病等疾病的治疗中应用广泛^[1,2]。研究表明毛冬青主要含有的三萜及其苷类成分具抗血栓作用^[3,4,5,6]。为了阐明毛冬青发挥临床治疗作用的有效成分及其作用机制，本课题组对其化学成分和心血管方面活性进行了系统研究，发现毛冬青中三萜类成分ilexsaponin A₁和ilexsaponin B₃具有抗血栓活性^[7,8]。

本课题组前期研究表明ilexoside O在毛冬青药材中的量可达0.33%，是毛冬青药材的主要成分之一，其结构和前期发现的抗血栓活性化合物非常类似，但其是否具有抗血栓活性尚无文献报道。由于ilexoside O为三萜皂苷类成分，极性较大，加之毛冬青药材中含有系列与其结构非常类似的皂苷类成分，因此分离制备足量化合物用于动物实验难度较大。本研究综合运用多种分离纯化技术从毛冬青根中分离制备三萜皂苷ilexoside O，采用波谱法对其结构进行了鉴定，并对其药理活性进行了研究。

核磁用Bruker AV 400型核磁共振仪（Bruker，Switzerland）；质谱用Finnigan LCQ Deca XP MAX液-质联用仪（Thermo Finnigan，CA，USA）；电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

毛冬青药材于2009年购自广州致信中药饮片有限公司，经广州中医药大学赵钟祥教授鉴定为冬青科冬青属植物毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arn. 的干燥根，样品（2009-3150）保存于本实验室；阿司匹林（亚宝药业太原制药有限公司，20100314）；肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号20110302）；柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；所有有机溶剂均为国产分析纯（广州化学试剂厂）。

昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半；SD大鼠，体质量（250±10）g，均为雄性。实验动物均由广州中医药大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK（粤）2008-0020，粤监证字2008A003。

毛冬青干燥根（12.0 kg）粉碎至粗粉，采用甲醇渗漉法提取，减压回收溶剂得总浸膏1.5 kg。浸膏加蒸馏水至4 L，充分分散后滤去沉淀，滤液分别用醋酸乙酯（4 L×3）和正丁醇（4 L×3）萃取。正丁醇萃取液减压回收溶剂至干，得浸膏350 g。取正丁醇部位300 g进行大孔树脂柱色谱，依次用水及15%、30%、70%、100%甲醇梯度洗脱。取70%甲醇洗脱组分进行硅胶柱色谱，氯仿-甲醇（100∶1→2∶1）梯度洗脱，以TLC进行检测、合并，得到15个部分（Fr. A_1-15）。Fr. A₄ 54 g通过反复硅胶柱色谱、重结晶（甲醇-水混合溶剂）等方法进行分离，得到三萜皂苷ilexoside O（3.5 g），质量分数≥98%。

化合物ilexoside O：羽状结晶（甲醇），TLC 10%硫酸-乙醇105 ℃加热显粉红色，Liebermann- Burchard和Molish反应呈阳性。ESI-MS m/z: 1097 [M＋Na]⁺。¹H-NMR (400 MHz,C₅D₅N) δ: 6.40 (1H,s,Rha-H-1),6.34 (1H,d,J = 8.0 Hz,28-O-Glc-H-1),5.80 (1H,d,J = 7.6 Hz,Glc-H-1),5.53 (1H,brt,J = 3.6 Hz,H-12),4.90 (1H,d,J = 6.8 Hz,Xyl-H-1),3.30 (1H,dd,J = 11.6,4.4 Hz,H-3),3.20 (1H,s,H-18),1.79 (1H,d,J = 6.4 Hz,Rha-H-6),1.73 (3H,s,H-27),1.41 (3H,s,H-29),1.35 (3H,s,H-23),1.20 (3H,s,H-26),1.12 (3H,s,H-24),1.01 (1H,d,J = 7.2 Hz,H-30),0.92 (3H,s,H-25)；¹³C-NMR (100 MHz,C₅D₅N) δ: 39.6 (C-1),27.4 (C-2),90.2 (C-3),40.3 (C-4),56.6 (C-5),19.3 (C-6),32.4 (C-7),41.0 (C-8),48.3 (C-9),37.6 (C-10),25.2 (C-11),128.2 (C-12),139.4 (C-13),42.7 (C-14),29.8 (C-15),27.2 (C-16),48.9 (C-17),47.8 (C-18),74.0 (C-19),43.3 (C-20),24.6 (C-21),34.1 (C-22),29.0 (C-23),16.1 (C-24),16.6 (C-25),18.0 (C-26),24.8 (C-27),177.6 (C-28),30.3 (C-29),17.3 (C-30)；106.3 (C-1′),80.0 (C-2′),78.3 (C-3′),71.77 (C-4′),67.1 (C-5′),102.9 (C-1″),79.8 (C-2″),79.7 (C-3″),73.24 (C-4″),79.6 (C-5″),63.9 (C-6″),102.5 (C-1′′′),72.90 (C-2′′′),73.17 (C-3′′′),74.9 (C-4′′′),70.0 (C-5′′′),19.5 (C-6′′′),96.3 (C-1′′′′),74.6 (C-2′′′′),79.5 (C-3′′′′),71.69 (C-4′′′′),79.3 (C-5′′′′),62.8 (C-6′′′′)。以上数据经与文献报道对照^[9,10]，鉴定化合物为ilexoside O。

取昆明种健康小鼠50只，体质量（20±2）g，随机分为5组：对照组（生理盐水），阿司匹林（50 mg/kg）组，ilexoside O高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）剂量组。分别按剂量ig给药，每日1次，连续给药5 d。末次给药后1 h后，采用玻片法测定CT。小鼠眼球采血，于载玻片两端各滴1滴血，血滴直径约5 mm，立即用秒表计时，每隔10 s用清洁大头针自血液边缘向里轻轻挑动1次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝时间即为CT，CT最长观察150 min，超过15 min不凝固的按30 min计算，另一滴血供最后复试^[11]。数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析处理，结果见表 1。毛冬青三萜ilexoside O高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）剂量组分别与对照组相比，

表 1(Table 1)

表 1 Ilexoside O对小鼠CT和BT的影响(x±s, n=10 ) Effect of ilexoside O on CT and BT 组别 剂量 / (mg∙kg-1) CT / s BT / s 对照 — 56±19 84±23 阿司匹林 50 79± 8** 123±30** ilexoside O 100 94±31** 124±30** 50 76±20 149±36** 25 65±14 119±24** 与对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01，下同 P < 0.05 **P < 0.01 vs control group,same as below

表 1 Ilexoside O对小鼠CT和BT的影响 (x±s, n=10 ) Table 1 Effect of ilexoside O on CT and BT in mice (x±s, n=10 )

小鼠BT明显延长，均有显著性差异（P＜0.05、0.01），而低剂量（25 mg/kg）组与对照组相比，对小鼠BT无明显影响（P＞0.05）。

取昆明种健康小鼠50只，体质量（20±2）g，分组、给药方法与剂量同“2.2”项，连续给药5 d。末次给药后1 h，采用断尾法测定小鼠BT。将小鼠固定，以毫米尺测量鼠尾长度并标记，然后用手术剪将小鼠尾尖4 mm处横断，待血液自行溢出开始计时，每隔10 s用滤纸吸去血滴一次，直至血流自然停止（滤纸吸时无血）为止，即为BT^[12]。BT最长观察30 min，超过30 min仍出血的按30 min计算。数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析处理，将各组的BT与对照组进行比较，结果见表 1。毛冬青三萜ilexoside O各剂量组对小鼠BT均有显著延长作用（P＜0.01）。

取SD大鼠50只，体质量（250±10）g，随机分为5组：对照组（生理盐水），肝素钠（1 250 U/kg）组，ilexoside O高（80 mg/kg）、中（40 mg/kg）、低（20 mg/kg）剂量组。除肝素钠组以外，均按剂量ig给药，每日1次，连续给药5 d；肝素钠组以背部sc给药，每间隔12 h给药1次，共给药2次。末次给药30 min后，大鼠麻醉后剖腹，分离腹主动脉段。然后用完全浸透50% FeCl₃溶液的滤纸条（1.0 cm×2.0 cm）环抱于分离出的腹主动脉段上，50 min后沿滤纸环边缘精确截取1.0 cm长血管段，吸干血管中的残留血液，精密称定质量，将除去血栓后的血管再次精密称定质量，前后两者相减即为该1.0 cm长血管段内血栓的质量^[13,14]。将各组的血栓质量与对照组进行比较。数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析处理，结果见表 2。毛冬青三萜ilexoside O高（80 mg/kg）、中（40 mg/kg）、低（20 mg/kg）剂量组均可明显减少FeCl₃诱导的大鼠腹主动脉血栓生成量（P＜0.01）。与低剂量组比较，高、中剂量组平均血栓质量分别下降了48.0%和24.0%，表明ilexoside O对血栓生成的抑制作用随给药剂量增加也相应增强，存在明显的剂量相关性，说明其具有良好的抗血栓活性。

表 2(Table 2)

表 2 Ilexoside O对FeCl3诱导的大鼠腹主动脉血栓生成量的影响(x±s, n=10 ) Table 2 Effect of ilexoside O on abdominal arterial thrombosis 组别 剂量 血栓质量 / mg 对照 — 8.8±1.8 肝素钠 1 250 U∙kg-1 1.8±0.6** ilexoside O 80 mg∙kg-1 2.6±0.6** 40 mg∙kg-1 3.8±0.6** 20 mg∙kg-1 5.0±1.3**

表 2 Ilexoside O对FeCl3诱导的大鼠腹主动脉血栓生成量的影响 Table 2 Effect of ilexoside O on abdominal arterial thrombosis induced by FeCl3 in rats (x±s, n=10 )

化学成分研究表明毛冬青中主要含有三萜及其苷类、木脂素类、环烯醚萜类化合物等，其中三萜及其苷类是毛冬青的主要成分和特征性成分。现代药理学研究表明，毛冬青提取物及单体具有显著的心血管方面的活性。由于毛冬青化学成分复杂，毛冬青发挥临床治疗作用的有效成分及作用机制至今尚未阐明。中药中的化学成分众多，获取足量用于药理活性研究的纯化合物难度较大，极大地困扰了中药药效物质基础研究。本研究通过对分离纯化条件的优化，充分结合色谱法和重结晶法的优点，制备了足量的三萜皂苷ilexoside O用于药理活性研究。

本研究通过在体实验发现，三萜皂苷ilexoside O各剂量组均能明显延长小鼠CT和BT，抑制FeCl₃诱导大鼠血栓形成，具有明显的抗凝血和抗血栓形成的作用。课题组的前期研究表明ilexoside O是毛冬青药材中的主要成分之一，据此推测三萜皂苷ilexoside O可能为毛冬青发挥心血管方面药理作用的有效成分，在防治血栓性疾病方面具有一定的应用前景。FeCl₃诱导动脉血栓模型既存在血小板活化和凝血系统激活，也存在抗凝和纤溶活性降低的血液病理变化，符合人类动脉血栓特征，被广泛应用于抗血栓药理研究^[14]。本研究中，三萜皂苷ilexoside O可以显著抑制FeCl₃诱导血栓形成，减轻血栓质量，推测其可能具有增强抗凝系统和纤溶系统活性的作用，其作用机制有待进一步深入研究。