摘要: 目的 利用RNA-Seq数据筛选天麻Gastrodia elata稳定表达的通用内参基因,并分析天麻素合成途径相关基因的表达模式,为天麻分子生物学研究提供技术支撑。方法 收集了天麻剑麻阶段块茎、茎、花的转录组数据集,以及接菌后4个不同发育时期的转录组数据集共2个RNA-Seq数据集。通过分别计算2个数据集的Transcripts Per Million(TPM)表达矩阵,并采用M值结尾均值(trimmed mean of M-values,TMM)方法进行标准化,获得最终的表达量文件genes.TMM.TPM.matrix。以变异系数(coefficient of variation,CV)均小于0.05为阈值,从2个表达量文件中共同筛选出稳定表达基因作为候选内参基因,并基于本地PrimerServer2软件包设计特异性引物。利用实时荧光定量PCR分别检测候选基因在天麻块茎不同发育时期及组织部位的表达水平,使用delta-CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper及RefFinder软件进行稳定性综合评价。同时,以筛选获得的最优内参基因分析天麻素合成途径上的6个关键酶基因的表达模式。结果Gelref1基因在不同组织部位及发育时期样品中表达最稳定,可作为本研究条件下天麻qRT-PCR分析的适宜内参基因。以该基因为内参,6个天麻素合成途径关键酶基因在不同发育时期组织部位的表达模式存在明显差异,其中多数基因在块茎发育中后期均高表达。结论 提出了一套基于RNA-Seq数据的天麻内参基因系统筛选流程,为后续天麻素生物合成途径的分子机制研究及功能基因验证奠定了基础。