利尿合剂为中山市中医院制剂（粤药制字Z20071008），由叶下珠、白花蛇舌草、金沙藤、一点红等中药组成，具有清热去湿、解毒通淋的功效，用于泌尿系统感染、慢性肾炎、膀胱炎、肾炎水肿、下焦不利。临床报道其对妊娠期^[1]和骨髓损伤^[2]引发的泌尿系感染，以及对慢性肾炎、膀胱炎、肾炎水肿、下焦不利等泌尿系感染^[3]均有较好的作用，可缓解泌尿系感染患者尿频、尿急、尿痛、小腹坠胀等症状，缩短患者白细胞、红细胞好转时间，缩短患者中段尿细菌清除率^[4]。但一直以来对本制剂的药理作用缺乏研究，本课题组对利尿合剂的抗炎、镇痛及体外抑菌作用进行了初步研究。

利尿合剂（由中山市中医院制剂室提供，批号20150903，含0.90 g生药/mL，规格100 mL/瓶）；吲哚美辛肠溶片（消炎痛，广东华南药业股份有限公司，批号140401，含吲哚美辛25 mg/片，规格100片/瓶）。

二甲苯、冰醋酸（广州化学试剂厂，批号分别为970302-2、20070902-2）；伊文思兰（中国医药公司，批号871225）；甲醛（分析纯）、70%乙醇（AR）、蒸馏水、即用MH琼脂培养基（江门市凯琳贸易有限公司）；营养肉汤（广东环凯生物科技有限公司）；药敏纸片（OXOID，广州纳特生物科技有限公司）。

革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，ATCC29213；革兰阴性菌：大肠埃希菌Pseudomonas aeruginosa，ATCC25922；两种标准菌株均为国家卫生计生委临床检验中心提供。

SPF级昆明种小鼠，体质量（20±2）g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（粤）2013-0034。饲养于广东省中山市中医院中药药理实验室，环境温度（22±2）℃，相对湿度50%~60%。根据实验性质和性别分笼喂养，自由采食饮水。

YLS-Q4耳肿打耳器（直径8 mm，山东省医学科学院设备站）；UV-754型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）；TD25-WS48孔多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；JA1203电子天平（上海天平仪器厂）；LRH-250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）；XSW-CJ-2A标准型净化工作台（吴江市津化设备总厂）；LMQR-4060型立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；DL-ZD1浊度仪（珠海迪尔生物工程有限公司）。

取小鼠50只，按体质量随机分成空白对照组、吲哚美辛（阳性药）组和利尿合剂高、中、低剂量组，每组10只，雌雄各半。空白对照组ig给予生理盐水；利尿合剂高、中、低剂量组分别ig给予18.0、9.0、4.5 g/kg（以生药计），低、中、高剂量为临床等效剂量的1、2、4倍，每天1次，连续给药7 d；第7天吲哚美辛组ig 0.013 g/kg吲哚美辛混悬液1次^[5-6]；给药体积均为20 mL/kg。

末次给药60 min后，各组小鼠右耳用精密移液器均匀涂以二甲苯30 μL/只双面致炎，左耳对照。20 min后脱颈椎处死动物，沿耳廓基线剪下两耳，剪去毛，叠加完整，用直径为8 mm打孔器在同一部位打下两圆耳片，精确称重。以左右耳片质量之差为肿胀度，计算肿胀抑制率。

最后一次给药后60 min，每只小鼠ip 0.6%冰醋酸溶液0.1 mL/10 g体质量致炎，记录20 min内扭体次数，并计算抑制率。

取小鼠52只，按体质量随机分成空白对照组、吲哚美辛（阳性药）组和利尿合剂高、中、低剂量组，空白对照组和吲哚美辛组11只，其余各组10只，雌雄各半。给药方式同“2.1”项，最后一次给药后60 min，每只小鼠尾iv 0.5%伊文思兰溶液0.1 mL/10 g，随即ip 0.6%冰醋酸溶液0.1 mL/10 g。注射醋酸50 min后脱颈椎处死小鼠，打开小鼠腹腔用5 mL冰生理盐水冲洗，并将冲洗液转移至10 mL容量瓶中加生理盐水定容至10 mL，所得定容液转移至试管中并3000 r/min离心10 min，取上清液，在紫外可见分光光度计590 nm波长处测吸光度（A）值，以A值表示腹腔液中的伊文思兰水平^[19]。计算抑制率。

于末次给药1 h于小鼠右后足趾sc 2.5%福尔马林溶液（20 μL/只），立即将小鼠置于小鼠笼中观测。以舔右后足趾时间为小鼠痛反应指标，分别记录小鼠注射后（0~10 min）和（10~30 min）的累计舔足时间，代表第Ⅰ、Ⅱ时相疼痛强度。计算疼痛抑制率。

两种实验标准菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌经平板分离培养24 h后，用无菌接种环挑选数个菌种置于生理盐水稀释液中，用浊度仪校正浓度至0.5麦氏标准液。

取利尿合剂20 mL（0.9 g /mL）高温高压灭菌后，用无菌水定容至20 mL。在净化工作台环境下操作，用微量移液器吸取30 μL药液均匀涂布于无菌空白药敏纸片，两面各15 μL，在无菌平皿中晾干备用。另吸取30 μL无菌生理盐水均匀涂布于无菌空白药敏纸片，两面各15 μL，晾干，制备成阴性对照纸片。

分别取“2.6.1”项菌悬液，在无菌操作条件下，用不同无菌棉棒均匀涂抹在琼脂培养基上，再用无菌镊子将晾干的药敏纸片和阴性对照纸片均匀间隔贴于各琼脂培养基表面，轻压纸片使接触良好，将培养基放入37 ℃恒温培养箱培养18~24 h后取出，测量并记录各抑菌圈直径，计算平均直径及抑菌率。判断标准：不敏感（≤6.25 mm，-）；低度敏感（≤7 mm，+）；中度敏感（＞7 mm，++）；高度敏感（≥15 mm，+++）。

采用SPSS 19.0软件处理。数据用x±s表示，采用单因素方差分析，进行Dunnet-t或t′检验。

对二甲苯致小鼠耳廓肿胀，阳性药吲哚美辛组、利尿合剂高剂量组与空白对照组比较，差异显著（P＜0.05、0.01）。结果提示，利尿合剂在18 g生药/kg剂量下对二甲苯致小鼠耳廓急性炎性肿胀具有显著抑制作用，抑制作用达76.65%，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 二甲苯致耳肿胀模型抗炎实验(x±s, n=10) Table 1 Anti-inflammatory experiment of ear swelling model induced by xylene (x±s, n=10) 组别 剂量/(g·kg-1) 肿胀度/mg 抑制率/% 空白对照 - 16.70±7.12 - 吲哚美辛  0.013 10.60±6.69* 36.53 利尿合剂 18.0 3.90±2.38** 76.65  9.0 11.30±3.62 32.34  4.5 12.70±1.70 23.95 与空白对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs blank control group, same as below

表 1 二甲苯致耳肿胀模型抗炎实验(x±s, n=10) Table 1 Anti-inflammatory experiment of ear swelling model induced by xylene (x±s, n=10)

如表 2所示，与空白对照组比较，吲哚美辛组和利尿合剂高、中、低剂量组均能明显减少冰醋酸致小鼠扭体反应次数（P＜0.05、0.01）；利尿合剂各剂量组对小鼠扭体反应次数的抑制率均高于吲哚美辛组，对冰醋酸致小鼠疼痛的抑制率呈剂量相关性，以18 g/kg剂量抑制率最高，为53.82%。结果提示，利尿合剂能对抗冰醋酸所致小鼠的疼痛性反应。其中利尿合剂高剂量组雌性5号动物ig第4天操作失误死亡。

表 2(Table 2)

表 2 冰醋酸致小鼠扭体反应模型镇痛实验(x±s) Table 2 Experimental model of mouse body twisting reaction induced by glacial acetic acid (x±s) 组别 n/只 剂量/(g·kg-1) 扭体次数 抑制率/% 空白对照 10 - 33.70±14.71 - 吲哚美辛 10  0.013 18.30±10.07* 45.70 利尿合剂  9 18.0 15.56±8.67** 53.82 10  9.0 16.30±9.89** 51.63 10  4.5 17.50±10.75** 48.07

表 2 冰醋酸致小鼠扭体反应模型镇痛实验(x±s) Table 2 Experimental model of mouse body twisting reaction induced by glacial acetic acid (x±s)

实验结果表明，吲哚美辛阳性对照组和利尿合剂高、中、低剂量组腹腔洗液的A值与空白对照组比较，在统计学上均有显著性差异（P＜0.05、0.01），提示利尿合剂对炎性过程中毛细血管通透性增加具有一定的抑制作用。结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加模型抗炎实验(x±s) Table 3 Capillary permeability increase model in mice induced by glacial acetic acid (x±s) 组别 n/只 剂量/(g·kg-1) A值 抑制率/% 空白对照 11 - 1.60±0.31 - 吲哚美辛 11  0.013 0.60±0.20** 62.50 利尿合剂 10 18.0 0.84±0.41** 47.50 10  9.0 1.05±0.50* 34.38 10  4.5 0.99±0.37** 38.13

表 3 冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加模型抗炎实验(x±s) Table 3 Capillary permeability increase model in mice induced by glacial acetic acid (x±s)

与空白对照组比较，吲哚美辛组可显著减少第Ⅰ、Ⅱ时相的疼痛强度（P＜0.05、0.01)，利尿合剂高、中、低剂量组均可显著降低第Ⅰ时相的疼痛强度（P＜0.01)，且3个剂量对第Ⅰ时相的疼痛抑制率均相当，分别为45.74%、47.18%、47.43%，利尿合剂3个剂量对第Ⅱ时相的疼痛强度没有显著降低作用作用。见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 福尔马林致痛模型镇痛实验(x±s, n=10) Table 4 Analgesic effects of Faure Marin induced pain model (x±s, n=10) 组别 剂量/(g·kg-1) 累计舔足时间/s 疼痛抑制率/% 第Ⅰ时相 第Ⅱ时相 第Ⅰ时相 第Ⅱ时相 空白对照 - 95.13±38.03 184.45±97.46 - - 吲哚美辛  0.013 58.96±27.08** 89.26±67.24* 38.02 51.61 利尿合剂 18.0 51.62±26.50** 123.98±82.10 45.74 32.78  9.0 50.25±14.75** 125.24±50.58 47.18 32.10  4.5 50.01±26.37** 107.32±75.48 47.43 41.82

表 4 福尔马林致痛模型镇痛实验(x±s, n=10) Table 4 Analgesic effects of Faure Marin induced pain model (x±s, n=10)

利尿合剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有不同程度的体外抑菌作用，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为95.04%、37.44%。结果见表 5和图 1。

表 5(Table 5)

表 5 利尿合剂抑菌作用及抑菌率(x±s, n=3) Table 5 Inhibitory effect and antibacterial rate of diuretic mixture (x±s, n=3) 实验菌 阴性对照纸片直径/mm 抑菌圈平均直径/mm 抑菌率/% 金葡球菌 6.25 12.19±2.31 95.04 大肠杆菌 6.25 8.59±1.26 37.44

表 5 利尿合剂抑菌作用及抑菌率(x±s, n=3) Table 5 Inhibitory effect and antibacterial rate of diuretic mixture (x±s, n=3)

图 1 利尿合剂对实验菌的抑菌作用 Fig. 1 Effect of diuretic mixture on test bacteria

本研究采用醋酸致小鼠疼痛扭体反应、福尔马林致小鼠疼痛舔足反应、二甲苯引起小鼠耳廓炎性肿胀反应及醋酸引起小鼠腹腔毛细血管炎性通透性反应，对利尿合剂的镇痛抗炎作用进行了观察。炎症是机体对损伤所产生的防御反应，二甲苯作用于小鼠耳廓，刺激肥大细胞释放组织胺、5-羟色胺等血管活性胺类，引起耳廓组织微血管扩张和通透性升高，组织液外渗，引发水肿^[8]。而稀醋酸中的H⁺可刺激腹腔毛细血管，使得其通透性增高，引发体液向腹腔内渗。伊文思兰可与血浆蛋白瞬间结合，随体液渗入腹腔，从而可通过检测腹腔内渗出的染料量推测出炎性物质的渗出量^[9]。本研究显示利尿合剂对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，使冰醋酸致炎后小鼠腹腔洗液伊文思兰A值显著降低，表明利尿合剂有显著的抗炎作用。

在扭体反应中，利尿合剂能显著抑制醋酸所致小鼠的疼痛扭体反应。sc福尔马林可通过刺激C纤维激活广动力背角神经元，引发疼痛，由此第Ⅰ相（0~10 min）时为直接刺激C纤维而引发疼痛，第Ⅱ相（10~30 min）则有炎症机制的参与而引发疼痛^[8]。本实验研究发现利尿合剂能显著抑制第Ⅰ时相的疼痛，对第Ⅱ相疼痛没有显著抑制作用，但整体3个剂量均能减少第Ⅱ时相的舔足累计时间，呈疼痛抑制作用趋势，具体原因仍有待进一步研究。

在体外抑菌实验中，利尿合剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别为95.04%、37.44%，由此表明，利尿合剂具有较好的抗炎镇痛作用，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有体外抑菌作用。

利尿合剂在我院临床用于肾炎、膀胱炎等泌尿系感染疾病治疗，本研究揭示了其在抗炎、镇痛及抑菌方面的药理作用，可为该制剂应用于临床提供药理依据。