异烟肼（Isoniazid），化学名4-吡啶甲酰肼，是结核病联合治疗中的首选药。本品相对分子质量为137.14，口服后几乎完全吸收，生物利用度达90%^[1]。属BCSⅢ类药物^[2]或BCSⅠ类^[3]，片剂的溶出行为直接影响药物的生物利用度。建立一个简单、专属性强，且具有较好区分力的溶出度试验方法是非常重要和必要的。《中国药典》2015年版溶出方法采用篮法100 r/min，溶出量测定为UV法，由于片剂通用的方法为桨法，且UV法专属性不强，所以测定方法的科学性有待进一步提高。为了对异烟肼片上市后的质量进行再评价，本文建立了异烟肼片体外溶出度评价方法，并对数家企业溶出曲线进行了比较分析。

Waters e2695高效液相色谱仪；Waters 1525-2487高效液相色谱仪；戴安Ultimate3000高效液相色谱仪；Mettler AE163电子天平；天大天发RCZ-8M溶出度仪；富科思FAVD-25真空脱气机；METTLER FiveEasy Plus酸度计。

异烟肼对照品（批号100578-201502，中国食品药品检定研究院）；异烟肼原料（批号T2014100，天津汉德威药业有限公司）；异烟肼片（美国山德士公司，规格100 mg，批号ME130036）；国内16家生产企业分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P。甲醇为色谱纯，水为超纯水，盐酸为优级纯，磷酸二氢钾、氢氧化钠、醋酸钠、冰醋酸、磷酸氢二钠均为分析纯。

称取过量异烟肼原料药置于25 mL具塞试管中，加入不同pH值的水溶液（pH1.0、pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0）各10 mL。在37℃水浴中振摇放置8 h。精密吸取上清溶液0.5 mL置500 mL量瓶内，加水稀释至刻度，摇匀。取上述各溶液按2.3.1的色谱条件测定。按《中国药典》2015年版HPLC外标法以峰面积计算各溶液中异烟肼的溶解度。异烟肼pH-溶解度结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 pH值-溶解度 Table 1 pH-Solubility pH 溶解度/（mg∙mL−1） 1.0 233 2.0 198 3.0 204 4.0 192 5.0 186 6.0 180 7.0 165 8.0 156

表 1 pH值-溶解度 Table 1 pH-Solubility

本品原研制剂为美国诺华制药的异烟肼片，现已停产。本文以FDA规定的参比制剂，美国诺华的分公司山德士公司的异烟肼片作为参比制剂^[4]。

篮法与桨法是各国药典收载的最普及的溶出方法。结合异烟肼的高溶解特性，本文选用浆法，50 r/min，可以较好地反映出慢速胃蠕动下的制剂溶出行为^[5]。

由表 1可见，异烟肼溶解性没有明显的pH相关性。同时结合日本橙皮书及FDA的建议，选择以下4种溶出介质：水、pH1.2盐酸缓冲液（取盐酸7.65 mL，加水稀释至1 000 mL）、pH4.5醋酸盐缓冲液（取醋酸钠18 g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀释至1 000 mL）、pH6.8磷酸盐缓冲液（取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL与0.2 mol/L氢氧化钠溶液112 mL混匀后，再加水稀释至1 000 mL）。介质体积采用900 mL。

溶出取样时间点为5、10、15、20、30、45、60 min，当连续两点溶出率均达85%，且差值小于5%时，可作为采样截止点^[6]。

C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.02 mol/L的磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节pH值至6.0±0.05）-甲醇（85׃15）为流动相，检测波长为262 nm，柱温为30℃，体积流量为1.0 mL/min^[5]。

精密称取异烟肼对照品约10 mg置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取异烟肼片1片，按上述溶出方法测定溶出度，取续滤液直接作为供试品溶液，在以pH1.2为介质时，色谱峰存在溶剂效应，取样品1 mL用水稀释至5 mL后进样。异烟肼典型HPLC色谱图见图 1。

A-对照品溶液；B-供试品溶液；C-空白辅料；1-异烟肼 A-reference solution; B-sample solution; C-excipients; 1-isoniazid 图 1 异烟肼HPLC色谱图 Fig. 1 Typical HPLC of isoniazid

精密称取淀粉约20 mg、硬脂酸镁约10 mg、预胶化淀粉约10 mg置100 mL量瓶中，加水振摇溶解并稀释至刻度，作为空白辅料溶液，进样测定。结果表明空白辅料在262 nm处无吸收，在主峰处无干扰（图 1）。表明该方法专属性良好。

精密称取异烟肼对照品适量，加水制成0.5 mg/mL的对照品储备溶液。分别精密量取对照品储备液0、1、2、3、4、5、6 mL至25 mL量瓶中，加水稀释制成不同浓度线性溶液。以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程分别为：Y=1.72×10⁴X−1.25×10⁴，r=0.999 3；结果表明，本方法中异烟肼在0.198 1~0.990 4 μg线性良好。

取质量浓度为0.1 mg/mL的异烟肼对照品溶液，重复进样6次，测得其RSD为0.1%，表明该方法精密度良好。

取4种溶出介质溶出度项下供试品溶液，各重复进样6次，测得其RSD均小于0.5%，表明该方法重复性良好。

取4种溶出介质溶出度项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，测得其在4种介质中的RSD分别为0.4%、0.2%、0.3%、0.3%，表明异烟肼在8 h内稳定。

称取异烟肼片适量，加水溶解稀释制成质量浓度约为0.5 mg/mL的供试品溶液，平行9份，平均分为3组，分别精密量取5 mL至50 mL量瓶中；各加入0.5 mg/mL的异烟肼对照品溶液各4、5、6 mL，分别相当于样品浓度的80%、100%和120%，平均回收率为100.2%。RSD%为0.5%（n=9）。

采用不同色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C₁₈ MG（250 mm×4.6 mm，5 μm）；资生堂CAPCELL PAK C₁₈ MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；赛默飞Thermo Acclaim^TM 120（250 mm×4.6 mm，5 μm）。不同色谱仪：戴安Ultimate3000；Waters 1525-2487；Waters e2695。不同人员进行试验，色谱行为均良好。表明该方法耐用性良好。

按上述溶出度试验方法测定了参比制剂山德士异烟肼片在4种溶出介质中的溶出曲线，见图 2。结果参比制剂在4种溶出介质中15 min时溶出量均达到85%以上，且在不同溶出介质中的溶出曲线基本重合。

图 2 参比制剂在四种溶出介质中的溶出曲线（n=6） Fig. 2 Dissolution curves of reference preparation in different media (n=6)

初步测定了国内5家生产企业在4种溶出介质中的溶出曲线，见图 3。结果企业B、C、D在4种溶出介质中15 min溶出量均达到85%以上。企业A、E在以水为介质进行比较时，15 min溶出量均低于85%，而在其他3种介质中15 min溶出量达到85%。在介质水中各厂家溶出差异较大，因此选择水作为后续溶出度试验介质^[7]。

A-pH 1. 2盐酸溶液；B-pH 4.5醋酸盐缓冲液；C-pH 6.8磷酸盐缓冲液；D-水 A-pH1.2 hydrochloric acid solution; B-pH4.5 acetate buffer solution; C-pH 6.8 phosphate buffer solution; D-water 图 3 不同企业样品在同种溶出介质中的溶出曲线（n=12） Fig. 3 Dissolution profiles of isoniazid tablets in different media (n=12)

本次试验共测定了国内16家生产企业在水中的溶出曲线。以山德士异烟肼片作为参比制剂，国内生产企业作为受试制剂，采用单点法或f₂因子法^[8]进行了相似性分析。当参比制剂与仿制制剂在15 min时溶出量均达到85%，直接判定两者溶出曲线相似；当参比制剂与受试制剂两者之一15 min溶出量未达到或均未达到85%时，进行f₂因子法相似性分析，选取时间点为5、10、15、20 min。

相似性分析结果见表 2。生产企业A、B、C、D、H、I、K、L、M、N、O、P与参比制剂相似；生产企业E、F、G、J与参比制剂不相似。

表 2(Table 2)

表 2 不同生产企业水中溶出曲线相似性评价结果（n=12） Table 2 Evaluation results of dissolution profile similarity of different manufactures in water (n=12) 生产企业 批号 溶出量/% f2 5 min 10 min 15 min 20 min A 140601 34.5 62.9 82.3 92.0 53 B 68140101 90.3 97.4 98.5 98.4 - C 150304 92.8 96.1 97.8 98.4 - D 1405041 42.8 90.8 96.1 97.3 - E 1404004 16.5 40.2 65.3 82.0 29 F 140202 21.2 36.9 49.5 60.4 23 G 150724-01 20.4 39.9 57.6 71.5 27 H 141101 38.3 79.9 95.2 95.8 - I 1406271 30.6 59.9 84.3 94.8 51 J 1403126 24.4 50.8 69.4 85.4 36 K 141202 27.7 81.6 96.5 97.2 - L 141001 30.9 87.6 96.4 97.7 - M 140901 91.5 96.5 96.5 96.4 - N 150601 36.0 64.2 84.2 94.7 57 O 20140602 35.9 63.5 84.3 96.3 56 P 150202 33.5 69.9 92.4 96.8 - 山德士 ME130036 38.2 75.1 93.7 95.6 100

表 2 不同生产企业水中溶出曲线相似性评价结果（n=12） Table 2 Evaluation results of dissolution profile similarity of different manufactures in water (n=12)

在进行异烟肼片溶出度方法研究过程中，作者采用光纤实时溶出仪，按照《中国药典》2015年版的溶出度方法进行了预实验，在以pH1.2为溶出介质时，用UV法测得的溶出量均高达120%，可见该方法并不能反映异烟肼片的真实溶出量。同时由于UV法测定溶出量时不能有效排除有关物质、辅料等的干扰，因此本文建立了专属性更强、准确度更高的HPLC法，并进行了方法验证。在以pH1.2为溶出介质进样时，色谱峰存在溶剂效应，所以将样品用水稀释5倍后进样。同步配制相同浓度的对照品溶液，并进行方法验证，精密度，重复性，线性，回收率均良好。该溶出度测定方法具有较强的区分力，可用于异烟肼片溶出曲线的测定。

国内异烟肼片处方较为简单，辅料主要为淀粉、硬脂酸镁及预胶化淀粉。作为一个高溶解性药物，处方组成、生产工艺可能是造成溶出行为差异的主要因素，在今后的研究中对各生产企业的异烟肼片，应进行多条溶出曲线的比较分析，以便全面了解国内各企业异烟肼片体外溶出状况。