槲皮素（quercetin）是一种黄酮类化合物，具有扩张血管、保护内皮功能、抑制心肌肥厚、祛痰、镇咳、抗癌等药理作用^[1]。结构式见图 1。由于无明显的毒副作用，成为近年来研究的热点^[2-3]。目前，槲皮素含量测定主要采用高效液相色谱法^[3]，尚未见核磁定量法（qNMR）测定其含量的报道。

图 1 槲皮素结构式 Fig. 1 The structure of quercetin

核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）技术最初主要用于化合物的结构确定，随着高强度磁场和傅里叶变换技术的应用，使得仪器的各项性能得到显著性的改善，从而为该技术应用于定量分析奠定了基础^[4-6]。qNMR法测定含量的基础是质子吸收峰面积与所包含的质子成正比，通常以已知含量的内标为参比，就可测得化合物的绝对含量。该法测定样品含量时不需对照品，无需引入校正因子，不受样品中水分、残留溶剂等干扰，且定性检定和定量分析同步完成，与HPLC法相比具有较大的优势^[5]。《中国药典》2010年版二部附录Ⅸ首次收载了qNMR法，其在含量测定方面的应用逐渐得到重视。本研究采用内标法对槲皮素含量测定方法进行了系统的方法学验证，并与质量平衡法进行比较，为槲皮素原料药质量控制提供新方法。

Bruker-400型核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；915KFTi-touch卡氏水分仪（瑞士万通）；分析天平（德国sartorius公司）；氘代DMSO（DMSO-d₆，Sigma公司）；槲皮素原料药（批号20131206，南京景竹生物科技有限公司）；马来酸对照品（批号190015-201302，中国食品药品检定研究院）；槲皮素对照品（批号100081-201209，中国食品药品检定研究院）。

精密称取马来酸56.78 mg溶于25 mL DMSO-d₆中，作为内标溶液。另精密称取槲皮素原料药4.19 mg，溶于1.0 mL内标溶液，转移0.5 mL至核磁管中待测。

采用zg30脉冲序列在恒温（295 K）下获取¹H-NMR。实验参数设置为：谱宽（SWH）8012 Hz，中心频率（O1）2 757 Hz，采样时间（AQ）4.0 s，弛豫延迟时间（D1）15 s，脉冲宽度（P1）9.54 μs，采样次数（NS）64次。

合适的氘代溶剂对内标及槲皮素溶解性较好，且内标谱峰不与样品峰谱峰发生重叠。氘代CDCl₃易挥发，测试过程中可能会导致样品浓度发生变化，因而选用DMSO-d₆作为溶剂。DMSO-d₆空白实验的¹H-NMR谱图，溶剂峰归属为δ2.50（quintet，DMSO-d₆峰），δ3.32（s，H₂O）。槲皮素¹H-NMR谱图及峰归属分别见图 2、表 1。与文献报道基本一致^[6]。

图 2 槲皮素的1H-NMR谱图 Fig. 2 Determination of quercetin with 1H-NMR spectral

表 1(Table 1)

表 1 槲皮素1H-NMR谱解析 Table 1 1H-NMR spectral date for quercetin. δ 氢个数 多重性 峰归属 6.17~6.19 1 d 6-H 6.39~6.41 1 d 8-H 6.82~6.90 1 d 5’-H 7.50~7.58 1 dd 6’-H 7.60~7.70 1 d 2’-H 9.28 1 s 3’-OH 9.33 1 s 4’-OH 9.56 1 s 3-OH 10.76 1 s 7-OH 12.48 1 s 5-OH

表 1 槲皮素1H-NMR谱解析 Table 1 1H-NMR spectral date for quercetin.

本实验选用DMSO-d₆作为溶剂，马来酸作为内标，与槲皮素混合物¹H-NMR谱图见图 3（图谱中仅显示δ6.0～6.6）。由图谱可知，马来酸溶剂峰归属为δ6.26（s，DMSO-d₆），与槲皮素附近的谱峰分离度较好，并选取槲皮素δ7.50～7.58（dd，6’-H）处作为槲皮素的定量峰。

精密称取槲皮素0.64、1.93、3.08、4.83、6.19 mg分别加入1 mL马来酸对照液，混匀后置于5 mm核磁管中。以槲皮素与马来酸定量峰面积比（A_s/A_r）对槲皮素与马来酸质量比（m_s/m_r）作线性回归，得出回归方程为y＝2.963 x＋0.134 1（r=0.999 3）。结果表明，以马来酸作为内标，用qNMR内标法测定样品中槲皮素含量，在0.64～6.19 mg/mL线性关系良好。

图 3 马来酸与槲皮素的1H-NMR谱图 Fig. 3 Determination of maleic acid and quercetin with 1H-NMR spectral

取供试品溶液，按“2.2”项下条件连续测定5次，获取¹H-NMR，调整相位并积分。计算定量峰与内标峰面积的比值。结果显示，其RSD＝0.84%。

取供试品溶液，按照“2.2”项下条件进行测定，获取¹H-NMR，调整相位并积分。计算定量峰与内标峰面积的比值，结果RSD＝1.39%。

取供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h按照“2.2”项下条件进行测定，获取¹H-NMR、积分。计算定量峰与内标峰面积的比值。计算RSD为1.56%，表明样品溶液在12 h内稳定。

取6份已测定含量的槲皮素样品，分别加入槲皮素对照品，并加入内标溶液配制样品溶液，按照“2.2”项下的测定条件获取¹H-NMR，计算回收率。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 加样回收率实验（n=6） Table 2 Experiment of average recovery rate (n=6) 样品含量/mg 标准品加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 1.48 2.54 4.05 101.57 1.31 2.54 3.82 98.82 3.12 2.54 5.60 97.64 99.54 1.57 2.96 2.54 5.53 101.18 4.24 2.54 6.74 98.42 4.04 2.54 6.57 99.61

表 2 加样回收率实验（n=6） Table 2 Experiment of average recovery rate (n=6)

取供试品，分别在耐用条件为温度（295±5）K，弛豫时间（15±1）s，脉冲宽度（9.54±0.5）μs，扫描次数（64±5）次进行耐用性实验。在上述耐用条件下，计算得到的RSD值最大为0.72%。因此采用的测试条件耐用性良好，满足分析要求。

平行配制3份样品，按照如下公式计算槲皮素的量，经计算3份槲皮素质量分数分别为85.20%、84.93%和85.27%，平均质量分数为85.13%，RSD为0.21%。

槲皮素%=[(A_s/n_s)×M_s×m_r]/ [(A_r/n_r)×M_r×m_s]×W_r

其中，A_s为槲皮素定量峰的积分面积；n_s为槲皮素定量峰代表的氢个数；M_s为槲皮素相对分子质量；A_r为马来酸定量峰的积分面积；n_r为马来酸定量峰代表的氢个数；M_r为马来酸相对分子质量；m_r为马来酸质量；W_r为马来酸质量分数；m_s为槲皮素质量。

HPLC面积归一化法结果为99.36%，卡氏水分测定结果为13.94%，炽灼残渣为0.11%，残留溶剂为0.0009%。质量平衡法计算结果为：（100%-水分%-炽灼残渣%-残留溶剂%）×HPLC面积归一化法测定结果%＝85.39%。可见，qNMR测定结果基本与质量平衡法结果一致。

D1要足够长，以使原子核完全弛豫，从而使被积分的信号强度与原子核数目成正比。本实验分别考察了D1为1、5、10、15、20、30 s时对槲皮素定量峰的影响。结果表明，当D1＞15 s时，A_s/A_r的比值趋于稳定，因此选择D1为15 s。考察了扫描次数（NS）对定量峰积分面积的影响。在D1设置为15 s前提下，分别对NS为16、32、64、96、128进行了考察。结果表明，当NS＞64时，A_s/A_r的比值趋于稳定。因此NS设定为64。O1的位置对定量分析的结果也会产生一定的影响，为使定量峰和内标峰在近似的射频场内测定，从而保证积分结果的准确性，O1应位于内标峰和样品定量峰的中间处，因此，O1设定为2 757 Hz，对应的O1P值为6.89。

槲皮素原料药中可能存在分子结构相近的山柰酚、异鼠李素等有关物质，δ6.0～7.0的质子峰会有关物质质子峰干扰。因此最终选取了槲皮素δ7.50～7.58（dd，6’-H）处作为定量峰。定量峰一般首先考虑峰型简单的质子峰^[7]，当峰型简单的质子不适合作为定量峰时，也可选择多重峰^[8]。但对定量峰积分时应将该峰放大，仔细调整相位，选取峰型轮廓线与基线重合处为其起、止点，多次积分后取其平均值。

质量平衡法测定结果与qNMR测定结果基本一致。但采用qNMR技术测定槲皮素含量，无需对照品，测试过程简单，快速准确，且结果可靠。为槲皮素原料药、相关制剂及标准品的质量控制提供有价值的参考。