2016, Vol. 39
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.06.014 |
2. 中国医科大学药学院, 辽宁 沈阳 110001;
3. 大连医科大学药学院, 辽宁 大连 116044
2. College of Pharmacy, China Medical University, Shenyang 110001, China ;
3. College of Pharmacy, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
雷公藤多苷是从卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. F.去皮根中提取精制的有效部位混合物，为我国首先研究利用的抗炎免疫调节中药提取物[1]。雷公藤多苷片与其他雷公藤制剂相比具有用量小、不良反应少等优点，早在1984年就投入临床使用，广泛应用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、白塞综合征、麻风、自身免疫性肝炎及皮肤病等疾病，疗效显著，其生理活性是由二萜内酯、生物碱、三萜等多种成分协同产生[2-4]。雷公藤多苷片是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂。
目前国内雷公藤多苷片还没有很完善的质量控制标准，报道中多以有效成分的含量测定为指标进行控制[5-9]，以至不同厂家的产品存在不同程度的差异，为了准确地控制雷公藤多苷片中有效成分群的含量，建立雷公藤多苷片的指纹图谱[10]，对其临床用药的有效性和安全性有很大的意义。本实验采用高效液相色谱法建立雷公藤多苷片指纹图谱，对市售的多个厂家的雷公藤多苷片进行指纹图谱研究，并利用主成分分析法（PCA）对指纹图谱进行统计分析，为更好地控制雷公藤多苷片的内在质量提供有用的参考。
1 仪器与试药Agilent LC 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent 1100型DAD检测器（美国Agilent公司），Chemstation for LC 3D色谱工作站（美国Agilent公司），AE200电子天平（Mettler），KQ2200B超声仪（昆山市超声仪器有限公司）
雷公藤粉末（江苏A制药有限公司），雷公藤多苷片（M1，江苏A制药有限公司，批号140319、140422、140513），雷公藤多苷片（M2，浙江B天然药物有限公司，批号131102），雷公藤多苷片（M3，黄石C制药有限公司，批号20140101），雷公藤多苷片（M4，上海D制药有限公司，批号140201），雷公藤多苷片（M5，安徽E药业有限公司，批号130701），雷公藤多苷片（M6，浙江F有限公司，批号1404123B），雷公藤多苷片（M7，湖南G药业有限公司，批号20140201），中性氧化铝（天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈（国药集团化学试剂有限公司），醋酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）。
2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备采用均匀取样法从雷公藤多苷片中取出15片，研细成粉，精密称取400 mg，置于25 mL三角烧瓶中。加入20 mL醋酸乙酯，超声提取30 min，滤过，滤液过15 g中性氧化铝柱，用30 mL醋酸乙酯洗脱，收集全部过柱后的洗脱液。回收醋酸乙酯，得残存物，加1.5 mL乙腈溶解，0.45 pm微孔滤膜滤过，备用。
2.2 色谱条件[6]色谱柱为Agilent C18色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱（0~70 min，35:65→100:0）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长218 nm；进样量20 μL。
2.3 指纹图谱方法学建立与测定按上述方法制备样品，测定了7个厂家的指纹图谱，色谱图差距较大，其中厂家A的指纹峰较多，因此以厂家A的3批雷公藤多苷片为供试品，注入色谱仪，记录色谱图，其典型的HPLC的色谱指纹图谱见图 1。共确立22个共有峰，其中20号色谱峰较强，且为7个厂家共有的色谱峰，选定其为内参比峰。其余6各厂家色谱图见图 2。
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图 1 雷公藤多苷片（厂家A）的HPLC色谱指纹图谱 Fig. 1 HPLC fingerprint of TGT |
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图 2 其余各厂家的HPLC色谱图 Fig. 2 HPLC Chromatogram of TGT of rest of the manufacturers |
2.3.1 稳定性试验
取厂家A雷公藤多苷片样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h进样测定。以20号峰为内参比峰，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果显示，22个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.58%、相对峰面积的RSD均小于5.78%。
2.3.2 精密度试验取厂家A雷公藤多苷片样品的供试品溶液，连续进样5次，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果22个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.54%、相对峰面积的RSD均小于4.65%。
2.3.3 重复性试验取厂家1雷公藤多苷片样品，平行取5份，按供试品溶液制备方法提取，得供试品溶液，分别进样检测，计算各共有峰的色谱相对保留时间和相对峰面积。结果显示，22个共有峰的色谱相对保留时间的RSD均小于0.66%、相对峰面积的RSD均小于5.85%。
2.3.4 指纹图谱的评价方法采用SIMCA-P软件进行PCA统计分析，以各主要色谱峰的保留时间和峰面积为变量得到score图和loading图。由score图可见厂家A的片剂和多苷提取物聚集在一个区域，而其他厂家则分散在不同区域，其中浙江产地的厂家B和F紧密聚集在同一区域，结果见图 2、3。
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图 2 Score分布图 Fig. 2 Score plots |
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图 3 Loading分布图 Fig. 3 Loading plots |
3 讨论
目前市售的雷公藤多苷片共有11家（2015年新增3家），本研究收集购买了7家产品进行研究比较，并采用SIMCA-P软件进行PCA统计分析，可更加直观的表明不同产地、不同厂家的雷公藤多苷片的区分情况，且划分区域明显，提示不同厂家因所用药材产地不同，所含化学成分及其含量有较大差别。本研究为更好地控制雷公藤多苷片的内在质量提供了有用的参考。
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