药物评价研究  2016, Vol. 39 Issue (5): 783-788
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.05.015
吴飞, 高晓欣, 胡宇驰, 曹春然, 高阳, 吕晶. 利多卡因凝胶对豚鼠的长期毒性试验研究[J]. 药物评价与研究, 2016, 39(5): 783-788.
WU Xiao-fei, GAO Xiao-xin, HU Yu-chi, CAO Chun-ran, GAO Yang, LV Jing. Experimental study on long-term toxicity of lidocaine gel in guinea pig[J]. Drug Evaluation Research, 2016, 39(5): 783-788.
利多卡因凝胶对豚鼠的长期毒性试验研究
吴飞, 高晓欣, 胡宇驰, 曹春然, 高阳, 吕晶     
北京市药品检验所药物安全评价中心, 北京 100035
收稿日期: 2016-03-15
作者简介: 吴虓飞, 男, 博士, 主管药师, 研究方向为药物安全评价。E-mail:wuxiaofei@bidc.org.cn
通信作者: 胡宇驰, 男, 硕士, 副主任药师, 研究方向为药物安全评价。E-mail:yuchihu@263.net
摘要: 目的 研究30 d重复皮肤涂抹利多卡因凝胶对豚鼠产生的毒性反应。 方法 利多卡因凝胶高、中、低剂量（40、20、10 g/kg）连续皮肤涂抹给药30 d，整个试验期间观察动物的临床症状，测定体质量和摄食量，分别于给药30 d及停药后14 d取部分豚鼠进行血液学、血清生化学、脏器系数和病理组织学检查。 结果 豚鼠未出现因给药而引起的异常症状，各给药组豚鼠体质量增长和摄食正常；利多卡因凝胶在10、20 g/kg剂量下，豚鼠血液学、血清生化学、脏器系数和病理组织学等均未见毒理学意义的异常改变；40 g/kg利多卡因凝胶导致豚鼠血清K+水平，肾上腺质量及系数明显增高（P < 0.05），但脏器未出现毒性病理改变；停药14 d后，上述异常指标恢复正常，也未见其他延迟毒性。 结论 在本试验条件下，皮肤涂抹利多卡因凝胶对豚鼠无明显毒性，无毒反应剂量为20 g/kg。
关键词: 利多卡因凝胶     长期毒性     皮肤给药     豚鼠     血清生化     脏器系数     病理组织学    
Experimental study on long-term toxicity of lidocaine gel in guinea pig
WU Xiao-fei, GAO Xiao-xin, HU Yu-chi, CAO Chun-ran, GAO Yang, LV Jing     
Drug Safety Evaluation Center, Beijing Institute for Drug Control, Beijing 100035, China
Abstract: Objective To observe the toxic reaction of lidocaine gel on guinea pig by long-term drug toxicity. Methods Daily dermal administration of lidocaine gel at 40, 20, and 10 g/kg for 30 d was used for high, medium, and low dose groups, respectively. Clinical observation, examination of body weight, and feed consumption were performed during whole experimental stage, and then, the hematology, blood-biochemics, organ coefficient, and pathohistology were examined in the end administration period and recovery period, respectively. Results No abnormity was found in all guinea pigs in terms of appearance, behavior, body weight and food consumption. Lidocaine gel has no toxicological abnormal changes of hematology, blood-biochemics, and pathohistology during end administration and convalescent periods at dose of 20 and 10 g/kg. Lidocaine gel of 40 g/kg significantly enhanced the levels of K+, and adrenal gland weight and coefficient in end administration period (P < 0.05), but toxicological abnormal change of pathohistology was not found, then above changed index regained normal and no other flaccid toxicity also was found in recovery period. Conclusion In the situation of this experiment, repeated dermal administration of lidocaine gel dose not lead to significant toxicity, and 20 g/kg of lidocaine gel is the non-toxic reaction dosage.
Key words: lidocaine gel     long-term toxicity     dermal administration     guinea pig     blood-biochemics     organ coefficient     pathohistology    

利多卡因凝胶是苏州纳通生物纳米技术有限公司生产的一种新剂型的局部麻醉药，功能主治为局部麻醉，暂时缓解疼痛。以往关于经皮给药制剂的临床前安全性评价，往往只考虑对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性）进行评价，而未考虑到经皮给药制剂对整个机体的毒性反应[1-2]。本研究为了进一步了解其临床长期用药的安全性，参照《化学药物长期毒性研究技术指导原则》的相关规定，严格按照GLP的要求，研究30 d重复皮肤涂抹给予利多卡因凝胶对豚鼠产生的不良反应，明确其毒性反应的症状和严重程度，确定其毒性靶器官，为拟订临床安全剂量、确定临床用药提供实验依据。

1 材料 1.1 药品与试剂

利多卡因凝胶（批号20101027，含5%利多卡因）、赋形剂对照（批号20111124，成分为不含利多卡因的空白基质），苏州纳通生物纳米技术有限公司；血清生化相关试剂，中生北控生物科技股份有限公司；血液分析相关试剂，日本光电工业株式会社授权上海东湖仪器试剂科技有限责任公司；凝血因子分析相关试剂，美国Instrumentation Laboratory公司；电解质分析相关试剂，英国朗道公司；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司；0.9%氯化钠注射液，天津药业焦作有限公司。

1.2 动物

SPF级Hartley豚鼠，160只，雌雄各半，体质量310～350 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）2012-0003。饲养环境为屏障级，温度22～24 ℃，相对湿度53%～64%，照明时间为10 h（明）/14 h（暗），饮用水为高压灭菌的生活饮用水。饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，批号12085113。

1.3 主要仪器

OLYMPUS AU400全自动生化仪（日本奥林巴斯公司）；Celltae MEK-6318K血细胞分析仪（日本光电工业株式会社）；EasyLYte PLUS Na/K/Cl ANALYZER电解质分析仪（美国MEDICA Corporation公司）；ACL ELITE PRO全自动血凝分析仪（美国Instrumentation Laboratory Corporation公司）；Nikon显微镜（日本尼康公司）；Leica ASP-200组织脱水机、Leica EG 1150H组织包埋机、Leica RM 2245半自动切片机、Leica H I 1210摊片机、Leica H I 1220烤片机、Leica Auto Stainer XL染色机、Leica DM 3000光学显微镜，均购自德国莱卡公司。

2 方法 2.1 剂量设置

利多卡因凝胶使用说明规定，400 mg凝胶涂抹于4 cm2的皮肤表面（0.1 g/cm2），成人使用面积不得超过100 cm2，儿童（体质量 < 20 kg）使用面积不得超过40 cm2，使用时间不超过2 h，每天最多涂抹于患处6次。因此，成人临床最大给药剂量为0.1 g/cm2×100 cm2×6次/60 kg＝1.0 g/kg，儿童临床最大给药剂量为0.1 g/cm2×40 cm2×6次/20 kg＝1.2 g/kg。

2.2 分组、给药及指标观察[3-4]

豚鼠检疫1周后，按体质量随机分为利多卡因凝胶高、中、低剂量（40、20、10 g/kg）组，赋形剂组和对照组，各组按0.1 g/cm2涂抹相应受试物，涂抹面积为动物体质量的10%（如体质量为400 g，涂抹面积为40 cm2），则每次涂抹剂量为：0.1 g/cm2×10%动物体质量/（动物体质量×0.001 kg）＝10 g/kg（大于人临床最大给药剂量的等效剂量）。利多卡因凝胶高、中、低剂量组，赋形剂组和对照组每天分别涂抹4、2、1、1、1次，对照组涂抹等量的氯化钠注射液，每0.1 g折算成11 mL。

每组32只豚鼠，雌性各半，给药前24 h用电推剪在豚鼠背部脊柱两侧对称剃毛，脱毛后24 h检查脱毛区域的皮肤，选择皮肤无破损的豚鼠进行试验，每天每次涂抹后用两层纱布和无刺激性胶布固定，多次给药的，给药间隔2 h以上，用温水清洗掉药物后再次给药，连续涂抹30 d，停药14 d。

在整个试验期间，每隔1周重复脱毛及称体质量1次，观察豚鼠摄食、体质量增长、行为活动等一般症状及中枢神经系统方面的症状，同时观察给药部位皮肤是否出现刺激性反应。分别在给药30 d和停药14 d取100和60只豚鼠（雌性各半），检测豚鼠血液学、血清生化学和电解质指标，脏器质量及系数指标，并进行脏器病理组织学检查。

2.3 检测指标

取血于血细胞分析仪上测定血液学指标（血细胞分析和网织红细胞计数）；于血凝分析仪上测定凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）。

取血分离血清（在2～8 ℃冰箱内放置1～2 h，2 2 500 r/min离心15 min分离血清），全自动生化分析仪上测定血清生化学指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、尿素（Urea）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、肌酸激酶（CK）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆固醇（CHO）、三酰甘油（TG）。

豚鼠ip 4%水合氯醛（10 mL/kg）麻醉，放血处死后，主要脏器进行全面尸检，肉眼观察各脏器有无病变异常情况（肉眼观察脏器大小、形态、色泽、质感的变化，并注意有无器官充血，水肿黏连和包块）；取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脊髓（颈、胸、腰段）、垂体、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、睾丸、附睾、前列腺、精囊、子宫、卵巢、膀胱、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、唾液腺（颌下腺）、胰腺、气管、主动脉、淋巴结、坐骨神经、肌肉、胸骨、乳腺及背部给药部位皮肤进行病理组织学检查，并称主要脏器的质量，计算脏器系数。

2.4 统计学分析

使用SPSS 11.5软件对数据进行统计分析，所有数据以x±s表示，进行单因素方差分析，然后根据方差分析结果进行Dunnett-t检验，比较各给药组与对照组数据均数的差异显著性。

3 结果 3.1 对动物临床症状的影响

给药期间，各组豚鼠未出现因给予利多卡因凝胶引起的毒性反应，外观体征、行为活动、呼吸、排泄等一般症状未见明显异常，也未见嗜睡、不安、步态不稳、抽搐、肌颤、惊厥等中枢神经系统的异常反应，涂药部位皮肤未出现刺激性反应。恢复期也未见延迟性毒性反应。

3.2 对体质量和摄食量的影响

给药期间和恢复期，利多卡因凝胶各剂量组及赋形剂组豚鼠体质量和摄食量与同期对照组比较，差异不显著。

3.3 对血液学指标的影响

给药30 d和停药14 d，利多卡因凝胶各剂量组和赋形剂组豚鼠血液学各项指标，与对照组比较，差异不显著。

3.4 对血清生化学指标的影响

表 1、2结果表明，给药30 d，利多卡因凝胶高剂量组血清K＋水平较对照组明显增高（P < 0.05），而其它各项血清生化学指标未见异常。停药14 d，利多卡因凝胶高剂量组豚鼠血清Urea较对照组明显增高（P < 0.05），而其他各项血清生化学指标未见异常。给药30 d和停药14 d，利多卡因凝胶中、低剂量组和赋形剂组血清生化学指标，与对照组比较，差异不显著。

表 1 利多卡因凝胶给药30 d对豚鼠血清生化学指标的影响(x±s, n=20) Table 1 Effect of lidocaine gel on blood-biochemics of guinea pigs after 30 d administration (x±s, n=20)

表 2 恢复期利多卡因凝胶对豚鼠血清生化学指标的影响(x±s, n=12) Table 2 Effect of lidocaine gel on blood-biochemics of guinea pigs in convalescent period (x±s, n=12)

3.5 对脏器质量及系数的影响

给药30 d和停药14 d，尸检肉眼观察各给药组豚鼠脏器均未见病变异常。表 3、4结果表明，给药30 d，与对照组比较，利多卡因凝胶高剂量组精囊腺质量明显降低（P < 0.05），肾上腺质量及系数明显增高（P < 0.05），其余脏器质量及系数与对照组比较，差异不显著。利多卡因凝胶中、低剂量组豚鼠脏器质量及系数与对照组比较，差异不显著。

表 3 利多卡因凝胶给药30 d对豚鼠脏器质量的影响(x±s, n=20) Table 3 Effect of lidocaine gel on organ weight of guinea pigs after 30 d administration (x±s, n=20)

表 4 利多卡因凝胶给药30 d对豚鼠脏器系数的影响(x±s, n=20) Table 4 Effect of lidocaine gel on organ index of guinea pigs after 30 d administration (x±s, n=20)

表 5、6结果表明，停药14 d，利多卡因凝胶中剂量组精囊腺质量及系数较对照组明显增高（P < 0.05），其余脏器质量及系数与对照组比较，差异不显著；高、低剂量组豚鼠脏器质量及系数与对照组比较，差异不显著。

表 5 恢复期利多卡因凝胶对豚鼠脏器质量的影响(x±s, n=12) Table 5 Effect of lidocaine gel on organ weight of guinea pigs in convalescent period (x±s, n=12)

表 6 恢复期利多卡因凝胶对豚鼠脏器系数的影响(x±s, n=12) Table 6 Effect of lidocaine gel on organ index of guinea pigs in convalescent period (x±s, n=12)

3.6 病理组织学检查

病理组织学检查未见受检脏器出现与利多卡因凝胶和赋形剂有关的毒性病理变化，停药14 d，各受检脏器也未见延迟性毒性反应。

4 讨论

本研究通过豚鼠皮肤涂抹利多卡因凝胶30 d长期毒性试验研究，对这种新剂型的局部麻醉药进行整体安全性评价，为临床试验剂量及观察指标提供参考。本品成人和儿童临床最大涂抹剂量分别为1.0和1.2 g/kg。为充分暴露本品毒性，按最大给药面积（按动物体质量的10%计算）来设置豚鼠的给药剂量，高、中、低剂量分别给药4、2、1次，则豚鼠给药的高、中、低剂量分别为40、20、10 g/kg，此剂量相当于成人剂量的40、20、10倍，儿童剂量的33、17、8倍。

症状观察未见因给予利多卡因凝胶而引起的局部皮肤异常反应和全身毒性反应，各组豚鼠体质量增长和摄食量正常，未出现与给药剂量相对应的差异变化趋势，停药后，各组豚鼠体质量和摄食量未见延迟性变化。

各项指标检测结果显示，血液学未出现与利多卡因凝胶有关的异常改变。但40 g/kg利多卡因凝胶可以升高血清中K+水平，停药14 d，K+水平恢复正常。利多卡因为IB类抗心律失常药物，可降低浦肯野纤维自律性，促进心肌细胞K+外流而发挥抗心律失常作用[5-6]，心肌细胞K+外流有可能导致血清中K+水平增高。本试验结果证实，利多卡因凝胶20、40 g/kg均可增加血清中K+水平，且具有剂量依赖关系。停药14 d，利多卡因凝胶高剂量组血清Urea水平显著增高，Urea数值虽有统计学意义，但无剂量依赖关系，且异常数值在正常参考值范围内，所以可能并非药物毒性引起的改变。

利多卡因凝胶40 g/kg导致肾上腺质量及系数显著增高，且具有剂量依赖关系，停药14 d，肾上腺质量及系数恢复；利多卡因凝胶中、高剂量精囊腺部分数值虽有统计学意义，但无剂量依赖关系，且异常数值在正常参考值范围内，所以可能并非药物毒性引起的改变。病理组织学检查未见受检脏器出现与利多卡因凝胶有关的毒性病理变化，也未见恢复期各受检脏器出现延迟性毒性反应。

由此可见，利多卡因凝胶作用的靶器官可能是心脏，导致心肌细胞K+外流后，血清中K+水平增高，但并未引起心脏出现病理改变。另外，利多卡因凝胶40 g/kg可能会影响到豚鼠肾上腺功能，导致肾上腺质量及系数增高，但也未引起肾上腺出现病理改变。

长期毒性研究是新药临床前安评的重要内容之一，大剂量长时间重复给药，预测药物可能对人体产生的不良反应，判断药物毒性靶器官，推测长期用药的安全范围，对临床用药具有重要指导意义。在本试验条件下，连续皮肤涂抹利多卡因凝胶30 d，对豚鼠无毒最高剂量为20 g/kg。

参考文献
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