高血压病在中医学中属于“眩晕”范畴^[1]。按中医辨证分型，高血压分为肝火亢盛、肝肾阴虚、痰湿壅盛、瘀血阻络四型，痰湿壅盛是高血压重要证型之一。现代研究表明，高脂血症与中医痰浊密切相关，痰浊是高血压病的重要病机之一。痰证与血液流变学、氧自由基、糖代谢、能量代谢酶等皆密切相关^[2]。半夏白术天麻汤来源于《医学心悟》，由半夏、天麻、茯苓、橘红、白术、甘草组成，是在“化痰祖方”二陈汤（半夏、橘红、茯苓、甘草）的基础上加天麻、白术而成，具有燥湿化痰，平肝息风的功效，临床主要用于治疗高血压病痰湿壅盛证^[3-5]。

单胺类神经递质及其代谢产物主要有肾上腺素（E）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）等，其中结构为儿茶酚胺类的有E、NE、DA等，结构为吲哚胺的有5-HT、5-HIAA。NE是重要的单胺类神经递质，可以直接作用于心血管系统，也可通过影响其他递质的释放，如与血管紧张素II（Ang II）相互影响，使血管收缩、血容量增加、引起血压升高^[6]。已知交感神经异常兴奋参与高血压的发病机制，而5-HT升高是交感神经兴奋的始动因素之一。当交感神经兴奋时，儿茶酚胺分泌增加可使血小板激活，释放5-HT又起到传播继发性聚集和加强释放反应的作用，以构成自身维持及不断升高的恶性循环。外周5-HT主要储存在血小板中，于血小板激活时释放出来使血浆浓度升高。因此准确测定血浆中NE和5-HT的浓度变化对于高血压等相关疾病的诊断和转归变化有重要意义^[7]。

基于“化学等值不一定生物等效，重在机体药效学反应”的原则，本实验在一定规格中空纤维膜截留相对分子质量≤1 000提取液作为最终产物，优选出半仿生-酶（SBEE）法提取工艺条件的基础上，采用痰湿壅盛型高血压大鼠模型，观察SBEE、半仿生提取（SBE）、醇提（AE）和水提（WE）4种方法的半夏白术天麻汤相对分子质量≤1000提取液对模型大鼠单胺类神经递质及其代谢产物的影响，探讨半夏白术天麻汤用半仿生-酶（SBEE）法进行提取超滤膜截留相对分子质量≤1000提取物的科学性和合理性。

1 材料 1.1 主要仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（二元泵、自动进样器、柱温箱、电子俘获（ECD）检测器，美国安捷伦科技有限公司）；BP-6型动物无创血压测试仪（成都泰盟科技有限公司）；DDL-5低速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；Beckman CX7全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）；Cobase 411全自动化学发光分析仪（电化学发光免疫检测仪器，美国罗氏诊断有限公司）；LXJ-②型离心沉淀机（上海第三分析仪器厂）；BL-420E＋型生物机能实验系统（四川成都泰盟电子公司）；KL-A型双河颗粒饲料机（余杭双河机械厂）；全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；血清超滤器（上海德宏生物医学科技发展有限公司）；ACS-6型电子秤（山东济南风华电子衡器有限公司）；游标卡尺（中国宁波量具一厂）；定量取液器（上海金林生化试剂仪器厂）；环形塑料管（泰州市科华电器有限公司）。

1.2 药材

本实验所用中药材，均购置于山东省中医院药房。经张兆旺教授鉴定：半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternate (Thunb.) Breit.的干燥块茎；天麻为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎；茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核；橘红为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥外层果皮；白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎。

1.3 动物

普通级雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，由山东中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXR（鲁）2011-0003。血压正常，分笼喂养，自由摄食饮水，每日早晚喂食，隔日换水。明暗时间间隔12 h，室温控制在25 ℃，湿度50%左右。

1.4 主要试剂

NE、5-HT对照品（SIGMA.A.R级）、乙酸钠、柠檬酸、正二丁胺、辛烷基磺酸钠、乙二胺四乙酸，美国AMRESCO公司；高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯，天津市康科德科技有限公司；水为自制高纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 半夏白术天麻汤提取液的制备

SBEE液的制备^[8]：将处方中药分别粉碎，按比例称取10～20目的粗粉，将方药粗粉先用适宜的纤维素酶（以饮片质量计）预处理24 h；提取3次，提取用水量依次为粗粉质量的10、8、8倍量；第1和3煎加入适宜的消化酶；水的pH值依次为2.0、6.5、9.0；提取时间依次为90、60、60 min；提取温度为（61±1）℃；提取液依次粗滤，3 500 r/min离心25 min，中空纤维膜（相对分子质量≤1000）滤过、浓缩、合并，浓缩至2.83 g/mL，即得。其中主要有效成分天麻素的质量分数为0.1%、甘草次酸的质量分数为5%。

SBE液的制备^[8]：将处方中药分别粉碎，按比例称取10～20目的粗粉，分别提取3次，加水量依次为10、8、8倍，3煎用水的pH值依次为2.0、6.5、8.5；提取时间依次为120、90、90 min。提取液依次粗滤，3 500 r/min离心25 min，中空纤维膜（相对分子质量≤1 000）滤过，浓缩、合并，浓缩至2.83 g/mL，即得。主要有效成分天麻素的质量分数为0.13%、甘草次酸的质量分数为2.3%。

WE液的制备^[8]：将处方中药分别粉碎，按比例称取10～20目的粗粉，分别提取3次，加水量依次为10、8、8倍，提取时间依次为120、90、90 min，提取液依次粗滤，3 500 r/min离心25 min，中空纤维膜（相对分子质量≤1 000）滤过，浓缩、合并，浓缩至2.83 g/mL，即得。主要有效成分天麻素的质量分数为0.095%、甘草次酸的质量分数为2.7%。

AE液的制备^[8]：将处方中药分别粉碎，按比例称取10～20目之间的粗粉，80%乙醇提取3次，加醇量依次为10、8、8倍，提取时间依次为1、0.5、0.5 h，提取液依次粗滤，3 500 r/min离心25 min，中空纤维膜（相对分子质量≤1 000）滤过、浓缩、合并，浓缩至2.83 g/mL，即得。主要有效成分天麻素的质量分数为0.08%、甘草次酸的质量分数为1.6%。

2.2 造模方法

对照组喂普通饲料，模型组喂高脂高盐饲料，饲料配方见表 1。持续喂养16周后测量体质量、尾动脉收缩压、舒张压。收缩压≥140 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mmHg，同时形体肥胖、体质量明显增加、纳呆嗜睡、懒动、不思饮水、大便不成形者为痰湿壅盛型高血压大鼠动物模型^[9-10]。

2.3 药物干预方法

将痰湿壅盛型模型高血压大鼠按照血压随机分为5组：模型组、SBEE组、SBE组、WE组、AE组，另设对照组（正常大鼠），每组8只。对照组饮去离子水，不限量，SBEE组、SBE组、WE组、AE组分别ig给予相应的提取液，每天1 mL（2.83 g/mL）。按以上方法喂养4周，取尾静脉血，血液凝固后，3 000 r/min离心10 min，用吸管分离出血清，用于测定。

2.4 大鼠血清中单胺类递质的水平测定^[11-13] 2.4.1 色谱条件

Diamonsil TM（钻石）C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）；缓冲液：乙酸钠100 mmol/L、柠檬酸85 mmol/L、正二丁胺0.4 mmol/L、辛烷基磺酸钠1.5 mmol/L、乙二胺四乙酸（EDTA）0.2 mmol/L，调pH值为3.7；流动相为甲醇-缓冲液（18:82），抽滤、脱气；体积流量0.9 mL/min；进样量20 μL；柱温18 ℃；工作电压0.4 mV、量程1 μA。

2.4.2 对照液及供试液的制备

分别精密称取NE、5-HT适量，用流动相溶解并稀释成300 μg/mL的标准对照品液。

分别精密移取血清200 μL置于1.5 mL EP管内，再加入等体积的5%高氯酸溶液，加盖后摇匀，室温放置20 min以充分沉淀血清中的蛋白质，10 000 r/min离心15 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试液。

2.4.3 系统适用性试验

以5-HT峰计，理论塔板数不得少于900、以NE峰计，理论塔板数不得少于2 000；5-HT、NE色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5；灵敏度试验结果信噪比均大于10；拖尾因子T值在0.95～1.05，符合药典要求。

2.4.4 专属性考察

取“2.4.2”项对照液和供试液上样，进行专属性考察试验，结果见图 1。大鼠血清样品中5-HT、NE分离度良好。

2.4.5 线性关系考察

取“2.4.2”项下对照液，分别稀释成NE：0.03、0.30、0.60、1.50、3.00 μg/mL，5-HT：0.03、0.15、0.60、1.50、3.00 μg/mL。按“2.4.1”项下色谱条件测定，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。NE回归方程为：Y＝2 661.5X＋14.943，R＝0.999 8，在0.03～3.00 μg/mL线性关系良好；5-HT回归方程为：Y＝3 375.4 X＋469.82，R＝0.999 5，在0.03～3.00 μg/mL线性关系良好；信噪比S/N＝3时，最低检测限为0.008 μg/mL。

2.4.6 精密度、稳定性试验

取“2.4.5”项下NE（0.6 μg/mL）、5-HT（0.15 μg/mL）溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，分别于0、1、2、4、6、8 h各进样1次，每次20 μL，测定峰面积，代入“2.4.5”项回归方程，计算NE和5-HT质量浓度。结果表明，仪器精密度良好，NE和5-HT的RSD分别为2.47%、1.34%，且NE和5-HT对照品至少在8 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验

按“2.4.2”项下供试液的制备方法平行制备5次，按“2.4.1”项下色谱条件，测定NE、5-HT峰面积，代入“2.4.5”项回归方程，计算NE和5-HT的质量浓度。NE和5-HT的RSD分别为1.85%、1.58%，表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

2.4.8 回收率试验

1）相对回收率试验 将不同大鼠的血清混合，作为相对回收率试验用样品，进样测定4次，求出平均水平作为空白值。取同量血清，加入高、中、低不同量的NE、5-HT对照品进样测定，代入“2.4.5”项回归方程，计算质量浓度，每个浓度平行测定5份，求平均值。计算相对回收率，相对回收率＝（测定量－空白值）/对照品加入量，结果见表 2。可见，各组分的相对回收率在98%～102%，效果良好。

2）绝对回收率试验 分别精密称取NE、5-HT对照品，其中一份加到空白血清样品中，按“2.4.2”项下方法制备成供试液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，测得A₁值；另一份用流动相溶解并稀释成300 μg/mL的标准液，进样测得A₂，按照公式计算绝对回收率＝A₁/A₂，计算得绝对回收率。设置高、中、低3个浓度，绝对回收率达60%～80%，效果良好。结果见表 3。

2.4.9 血清中单胺类递质水平测定结果

将各组大鼠血清按“2.4.2”项下方法制备成供试液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，NE、5-HT测定结果按照关系式：R_{1, 2}=x₀/x（x₀为模型组大鼠NE、5-HT的平均值，x为各组NE或5-HT的平均值）进行处理。R＝R₁＋R₂，R值作为评判值，大者为优。结果见表 4。SBEE法综合评判指标R值最大，即半夏白术天麻汤提取方法以SBEE法效果较好。

4 讨论

结果表明，半夏白术天麻汤可降低痰湿壅盛型高血压大鼠血浆中NE和5-HT的水平，R₁值的大小次序为SBEE组 > SBE组 > AE组 > WE组，R₂值的大小次序为SBEE组 > SBE组 > AE组 > WE组。SBE法的提取温度沿袭水提法的100 ℃，虽然高温条件可以提高提取效率，但是，也可能会影响某些药效成分的活性，而且过多的粗提物给精制和浓缩带来不便。SBEE法是在SBE法的基础上，将生物酶提取技术引入SBE法的理论体系，仍然坚持“有成分论，不惟成分论，重在机体药效学反应”的SBE法观点，是SBE法的进一步“仿生化”研究设计。它与单纯的酶提取法不同，不是针对某个特定成分选择合适的酶以提高其提取率，也不考虑该成分是否被酶解，酶对其他活性成分是否有影响，即不以分解或转化一个或多个成分来判断提取效果的好坏，而是把一味中药或复方看成一个整体，以单体成分、活性混合物，指纹图谱和药效学等多指标综合判断。

本实验采用高效液相色谱-电化学（HPLC-ECD）法测定单胺类递质，灵敏度高，无需衍生化，操作过程简单、快速，且大鼠血清中单胺类递质水平较低，电化学检测器的检测限要比一般的紫外以及荧光检测器低，是一种灵敏度很高的检测器，可达到皮克级水平。可广泛应用于大鼠血清及组织中单胺类神经递质的研究，也可用于临床中检测人血清中单胺类神经递质的研究。

供试血样和对照液的储存：要储藏于－20 ℃的冰箱中，以防止其分解。尤其是5-HT在血清中水平很低，对光、氧、酸碱环境很敏感^[14]，极易分解。因此样品的处理就显得格外重要。

经对380余种常用中药中已知活性成分进行统计，绝大多数相对分子质量≤1 000，这也与“中药活性成分分子量表”对245种成分的统计结果相符合^[15]。多数蛋白质、淀粉、多糖、树脂等大分子的物质没有药理活性，即使对有效成分一无所知的中药，也可以相对分子质量≤1 000的提取物为指标，选择提取工艺和控制其质量。以相对分子质量≤1 000提取物为最终产物，较通常以粗提物为最终产物，不仅能体现中药整体、综合、客观、模糊的特点，而且可降低提取物量，缩小服用量，也为选用现代药物新剂型提供了可能。对单体成分未知的中药及其复方，用相对分子质量≤1 000的提取物量为指标，选择提取工艺和控制质量，对中药现代化研究很有借鉴意义^[16-17]。