金丝桃苷(Hyp),又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,属于黄酮醇苷类化合物,其苷元为槲皮素,糖基部分为吡喃半乳糖。Hyp在天然植物中分布广泛,生物活性多样,具有潜在的应用前景。已有文献报道Hyp具有保肝护肝[1-2]、抗氧化[3-4]、保护心、脑血管[5-6]、保护神经系统[7-8]、抗肿瘤[9]、镇痛抗炎[10]等多种药理活性。其作用的分子机制可能和抗氧化应激、调节相关免疫分子表达相关。在文献回顾中发现,目前尚未见Hyp对急性炎症疼痛作用研究的相关报道,因此本课题组建立小鼠急性炎症疼痛模型,考察Hyp对此类模型的抗炎镇痛作用效果,为Hyp开发与利用提供理论参考和数据补充。
1 材料 1.1 动物SPF级昆明小鼠,体质量18~22 g,雌雄各半,购于北京维通利华公司。动物生产许可证号SCXK(京)2011-0011。
1.2 药品与试剂Hyp,购自中国食品药品管理研究院,批号111521-201507;氢化可的松注射液,购自天津金耀药业有限公司,批号151106,使用时用生理盐水配制;盐酸吗啡注射液,购自东北制药集团沈阳第一制药有限公司,规格1 mL:10 mg,批号160105-1;伊文思蓝,购自Sigma公司,批号E2129,实验时用生理盐水配制;二甲苯,批号20150506;冰醋酸,批号20140529,均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器电子天平,AL204 Mettler Toledo公司;TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;Z52型医用离心机,白洋离心机制造厂;甩尾仪,YLS-12A山东省医学科学院设备站。
2 方法 2.1 抗炎实验 2.1.1 剂量设置及给药方式参考已发表的相关文献数据[11]和预试实验结果,本实验采用sc给药方式,实验低、中、高3个剂量浓度分别设置为50、100、200 mg/kg。昆明种小鼠50只,根据体质量和性别随机分为5组:对照组,Hyp低、中、高剂量组,氢化可的松(20 mg/kg)组,每组10只。每天给药1次,连续给药5 d。
2.1.2 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀炎症模型的作用最后一次给药40 min后,10μL二甲苯均匀涂于小鼠右耳内外侧,左耳涂以同样体积的蒸馏水作对照。40 min后重复一次,再过40 min后脱颈处死小鼠,沿耳廓基线剪下双耳,用直径8 mm的打孔器分别在两耳同一部位打下圆耳片,迅速用电子天平秤质量,每只小鼠右耳片减去左耳片质量即为耳片炎症肿胀度,计算耳肿胀率和耳肿胀抑制率。
耳肿胀率=(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量
耳肿胀抑制率=(对照组平均肿胀率-给药组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率
2.1.3 对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的作用小鼠分组、给药方式、给药时间同“2.1.1”项。各组给药40 min后,小鼠尾iv 1%伊文思蓝生理盐水溶液,给药体积为5 mL/kg;同时ip浓度为1.2%的醋酸生理盐水,给药体积为5 mL/kg。40 min后脱颈椎处死小鼠,打开腹腔,10 mL生理盐水冲洗腹腔数次,收集洗液,离心取上清液,紫外分光光度计测定610 nm处各组吸光度(A)值。
2.2 镇痛实验 2.2.1 对冰醋酸所致小鼠扭体次数的影响昆明种小鼠50只,根据体质量和性别随机分为5组:对照组,Hyp低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组,吗啡(1 mg/kg)组,每组10只。每天给药1次,连续给药5 d。各组给药40 min后,小鼠ip 0.6%新鲜配制的冰醋酸溶液,给药体积为5 mL/kg。实验在温度25 ℃,光线较暗,安静的条件下进行,观察人员分别记录15和30 min内各组小鼠出现扭体反应的次数,计算各组药物扭体次数抑制率。
扭体次数抑制率=(对照组扭体反应次数-给药组扭体反应次数)/对照组扭体反应次数
2.2.2 对小鼠光热辐射甩尾痛阈值的影响正式分组前剔除未经任何处理对光热辐射刺痛超敏感和极不敏感的小鼠(在26 W的刺痛功率下,淘汰痛阈值小于3 s,和痛阈值大于12 s小鼠)。取用符合实验条件的小鼠,分组、给药方式、给药时间均同“2.2.1”项。甩尾仪实验功率设定为26 W,最大光照刺痛时间设置为16 s。以小鼠甩尾反应潜伏期作为痛阈,给药前每只小鼠测定痛阈值3次,3次的平均值作为基础痛阈。各组给药40 min后再测定其痛阈值,计算甩尾痛阈提高值。
甩尾痛阈提高=(给药组痛阈值-基础痛阈值)/给药组痛阈值
2.3 统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据均采用x±s表示,两组间比较采用t检验进行统计学处理分析,对所测定结果进行方差齐性检验,各组间比较使用单因素方差分析检验。
3 结果 3.1 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀炎症模型的影响与对照组比较,氢化可的松组,Hyp 100、200 mg/kg组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用(P < 0.05、0.01),表明Hyp可以剂量依赖性的改善二甲苯所致小鼠耳廓肿胀,结果见表 1。
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表 1 Hyp对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的拮抗作用(x±s, n=10) Table 1 Antagonism action of Hyp for auricle edema levels induced by xylene (x±s, n=10) |
3.2 对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型的作用
与对照组比较,氢化可的松组,Hyp 100、200 mg/kg组对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高具有明显的抑制作用(P < 0.05、0.01),表明Hyp可以剂量依赖性的改善醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高,结果见表 2。
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表 2 Hyp对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的抑制作用(x±s, n=10) Table 2 Inhibition of Hyp on increase of blood capillary leakage of abdominal cavity in mice induced by acetic acid (x±s, n=10) |
3.3 对冰醋酸所致小鼠扭体的作用
在15 min的观察时间内,与对照组比较,Hyp 200 mg/kg组对小鼠扭体次数有显著抑制作用(P < 0.05);在30 min的观察时间内,与对照组比较,Hyp 100、200 mg/kg组对小鼠扭体次数具有显著抑制作用(P < 0.05、0.01)。表明Hyp可以剂量依赖性的减少冰醋酸所致小鼠扭体次数,结果见表 3。
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表 3 Hyp对冰醋酸所致小鼠扭体次数的作用(x±s, n=10) Table 3 Effect of Hyp on number of writhing induced by acetic acid (x±s, n=10) |
3.4 对小鼠热甩尾痛阈值的作用
与对照组比较,吗啡组,Hyp 100、200 mg/kg组小鼠甩尾痛阈值明显提高(P < 0.05、0.01)。结果见表 4。
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表 4 Hyp对小鼠甩尾痛阈值的作用(x±s, n=10) Table 4 Effect of Hyp on pain threshold of thermal stimulation (x±s, n=10) |
4 讨论
Hu等[12]研究发现,在慢性炎性小鼠疼痛模型中,Hyp能够下调中脑导水管周围灰质中NMDA受体NR2B亚型水平,从而发挥持久的抗炎镇痛作用;Lee等[13]采用大鼠腹腔巨噬细胞炎性模型,发现Hyp通过降低p44/p42 MAPK、p38 MAPK和JNK分子的表达而下调iNOS表达,减少NO产生,发挥抗炎作用;Kim等[14]研究发现,Hyp可抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎症模型中的NF-κB活性,产生系列生理效应,达到抗炎作用;以上研究结果表明Hyp在调节慢性炎症免疫反应方面确可发挥积极作用。
在以血管通透性为主要改变的急性炎症模型实验中,本实验以小鼠急性炎症模型为研究对象,100、200 mg/kg的Hyp对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀的急性炎症具有明显的抑制作用,抑制率分别为21.40%、49.86%;在Hyp对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型的作用中,100、200 mg/kg的Hyp对醋酸引起的腹腔毛细血管通透性增高有明显的抑制作用,且随着剂量增大,抑制作用越明显。本研究结果表明,Hyp不仅对慢性炎症疼痛起到抗炎镇痛的作用,对于急性炎症模型也有较好的抑制作用。
陈志武等[15]以蛙坐骨神经疼痛模型为研究对象,发现Hyp能够抑制氯化钾诱发的钙离子内流,其镇痛作用可能与减少感觉神经末梢钙离子内流有密切关系。宋必卫等[16]以Hyp 5 μg/mL侧脑室注射的方式,在小鼠甩尾试验和热板法实验中证实了Hyp具有镇痛作用。本实验采用sc给药方式,以小鼠急性甩尾试验和醋酸扭体为研究模型,结果显示100、200 mg/kg的Hyp明显提高激光热刺激引起的小鼠的疼痛阈值,痛阈提高分别为39.0%、63.7%;能够明显抑制冰醋酸所致小鼠扭体的次数,其15 min的抑制率分别为16.5%、29.2%,30 min的抑制率分别为42.0%、61.7%。本实验结果显示,Hyp对于急性疼痛也具有一定的抑制作用。
醋酸扭体是一种经典的炎剂所致内脏疼痛模型,多用于评价和筛选甾体类抗炎药镇痛作用效果;辐射热刺激甩尾法模拟的是脊髓反射刺激,常用于麻醉性阵痛药物的评价和筛选。本研究中Hyp可能是抑制和下调了外周组织中的TNF-α、COX-2、NF-κB等相关炎症因子的表达,降低了炎症的侵害和发展,从而起到了抗炎镇痛的作用;其对于热辐射刺激甩尾镇痛机制,推测是抑制了中枢系统某些神经递质的表达,但其确切的作用机制目前尚不十分明确。有关Hyp的镇痛、抗炎机制方面,特别是对于其中枢镇痛作用机制,本课题组还将进一步做深入研究。
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