肺纤维化（PF）是肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化为主要病变的一类疾病，其主要症状包括呼吸困难、气短、干咳和喘憋，严重时会导致患者呼吸衰竭而死亡^[1]。目前对其发病机制仍不太清楚，随着环境污染的不断恶化，发病率正在逐年增加。目前西医的传统治疗手段主要是采用激素和免疫抑制剂类药物，但是疗效不理想而且还有副作用^[2]。中医文献没有关于肺纤维化的疾病名称，根据其症状可归属于“肺痹”“肺痿”“咳嗽”等，临床与实践表明，中医药治疗肺纤维化具有一定优势^[3-4]。邓家刚教授认为，肺纤维化形成的中医病机主要涉及正虚痰瘀等，并依据中医理论和多年的行医经验，组成“芒果三芪肺纤方”（原处方为：芒果叶、黄芪、三七）进行治疗肺纤维化的研究。

本研究主要是通过对此方中三味药的主要药效成分芒果苷、黄芪多糖、三七总皂苷进行中药组分配伍，应用中药药理学和分子生物学方法，对抗肿瘤药博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化进行药效及初步机制研究。肺纤维化是一种渐进的不可逆的疾病，大量的实验和前期的预实验研究表明^[5-6]，博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化于14 d开始出现症状，28 d已可以确诊。本研究从小鼠开始出现肺纤维化症状时给予药物干预，观察药物对肺纤维化的阻抑作用，以期为寻找一种安全有效的中药组分配伍方剂提供实验依据。

SPF级昆明种雄性小鼠，18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（桂）2009-0002。

黄芪，批号130901，购自广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，经广西中医药大学中药教研室覃文慧鉴定为豆科植物黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的根；三七，批号130902，购自广西玉林参宝堂中药饮片有限公司，经广西中医药大学中药教研室覃文慧鉴定为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen的干燥根；芒果叶，自采，经广西中医药大学中药教研室覃文慧鉴定为漆树科植物芒果Mangifera indica L.的树叶。

地塞米松磷酸钠注射液（规格1 mL、5 mg，广州白云山天心制药股份有限公司，批号130608）；注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，批号120901）；注射用黄芪多糖（天津赛诺制药有限公司，批号120901）；三七总皂苷（血塞通注射液，昆明制药集团股份有限公司，批号12EL02）；芒果苷（广西中医药大学中药药效筛选重点实验室提供，质量分数达98.39%以上）。

超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（HYP）试剂盒、考马斯亮兰（南京建成生物工程研究所）；IL-1β ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

BX60显微镜（日本OLYMPUS公司）；LG16-W高速低温离心机（德国Heraeus公司）；全波长酶标仪（美国Epoch Biotek公司）；TGL-16B和TGL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TU-1901/1900紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；EL204电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；HM355 S型全自动石蜡切片机（德国MICROM公司）、电热恒温培养箱、电热恒干燥箱（上海跃进公司）；D700型单反照相机显微摄像（日本尼康公司）；YQ-3匀浆器（广西医科大学科学实验中心）。

分别取原处方量的黄芪60 g、芒果叶30 g、三七10 g药材各3份，按以下方法进行提取，黄芪多糖：加30倍的水，70 ℃恒温提取15 min，提取3次，质量浓度分别为217.01、216.52、216.73 mg/g，平均216.73 mg/g^[7]；芒果苷：75%乙醇10倍用量，在640 W微波下提取10 min，质量浓度分别为132.78、132.72、132.79 mg/g，平均132.76 mg/g^[8]；三七总皂苷：75%乙醇超声波高频（50 kHz）提取3次、每次30 min、提取温度40 ℃，质量浓度分别为500.02、500.05、500.03 mg/g，平均500.03 mg/g^[9]。因此将芒果三芪肺纤方中药组分量定为黄芪多糖13.0 g、芒果苷4.0 g、三七总皂苷5.0 g。分别用购买的注射用黄芪多糖、芒果苷、三七总皂苷按处方制作成3种不同浓度的药液：芒果三芪肺纤方高、中、低浓度0.075、0.05、0.025 g/mL组。

小鼠乙醚吸入麻醉后，保持直立状，根据小鼠的呼吸，自鼻腔缓慢滴入6 mg/kg盐酸博莱霉素溶液，对照组滴入等量的无菌生理盐水，滴完后保持直立30 s，待其苏醒后给予水和饲料，肺纤维化小鼠模型制备完成。

60只昆明种雄性小鼠，随机分为6组：对照组、模型组、地塞米松（阳性药，1 mg/kg）组、芒果三芪肺纤方高、中、低剂量（以生药计5.0、3.3、1.65 mg/kg，分别取“2.1”项中质量浓度为0.075、0.05、0.025 g/mL的芒果三芪肺纤方给药）组，每组10只。模型建立14 d后，小鼠开始出现咳嗽、挠鼻现象，研究表明^[10-11]，造模后第14天小鼠肺组织病理切片观察开始出现肺泡炎症和轻微的肺纤维化。造模14 d后开始每天ig给药一次，连续给药14 d，对照组和模型组ig等量纯净水。

各组小鼠分别于给药14 d后处死，打开胸腔，取出肺脏，肺左大叶固定于4%多聚甲醛溶液中，常规石蜡包埋、切片，采用HE和Masson染色观察肺组织病理改变以及肺纤维化程度。

HE染色的病理切片，根据Szapiel方法将肺泡炎分为4级：I级，无肺泡炎症（0分）；II级，轻度肺泡炎症（1分）：单核细胞浸润使肺泡隔增宽，仅限于局部和近胸膜部，面积小于全肺的30%，肺泡结构一般正常；III级，中度肺泡炎症（2～3分）：受累面积占全肺的30%～70%，近胸膜部比较严重；IV级，重度肺泡炎症（4分）：受累面积大于70%，偶然会见到肺泡腔内有单核细胞和出血造成的实质性变化。

Masson染色后的病理切片，根据肺纤维化判断方法将肺纤维化程度分4级：I级，无肺纤维化（0分）；II级，轻度肺纤维化（1分）：受累面积小于20%；III级，中度肺纤维化（2分）：受累面积占全肺的20%～50%；IV级，重度肺纤维化（3分）：受累面积大于50%，肺泡结构比较紊乱。

取右肺中叶，在生理盐水中充分漂洗后，滤纸吸干表面水分，精密称取30～50 mg，于−80 ℃冰箱保存，待检测时，用生理盐水制备成10%肺组织匀浆，测定肺组织匀浆中的SOD活力和MDA、IL-1β、HYP水平，严格按照试剂盒说明书操作。

所有数据均以x±s表示，使用SPSS 17.0软件中单因素方差分析进行统计分析；Homegeneity检验方差齐性，若方差齐时采用最小显著法（LSD）检验；若方差不齐时采用Dunnett's U检验；等级资料采用非参数检验法进行统计分析。

模型组肺组织匀浆中SOD活力较对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组SOD活力均显著升高（P＜0.05、0.01）；芒果三芪肺纤方高剂量组SOD活力升高较明显，与对照组比较差异不显著；中和低剂量组与对照组比较，差异显著（P＜0.05）。

与对照组比较，模型组肺组织匀浆中MDA、HYP、IL-1β水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，地塞米松组、芒果三芪肺纤方高、中剂量组MDA、HYP和IL-1β水平均显著降低（P＜0.05、0.01），低剂量组HYP和IL-1β水平均显著降低（P＜0.01）。高剂量组MDA和HYP水平与对照组比较，差异不显著；中和低剂量组与对照组比较，差异显著（P＜0.05、0.01）。高、中、低剂量组IL-1β水平与对照组比较，差异均不显著。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠肺组织中SOD活力、MDA、HYP和IL-1β水平比较(x±s, n=10) Table 1 Comparison on activity of SOD, level of MDA, HYP, and IL-1β in lung tissue of mice (x±s, n=10) 组别 剂量/(g∙kg−1) SOD活力/(U∙mL−1) MDA/(nmoL∙mL−1) HYP/(μg∙mg−1) IL-1β/(pg∙mL−1) 对照 — 132.50±2.75 2.13±0.07 624.19±28.44 43.84±5.53 模型 — 104.30±2.30** 2.50±0.04** 782.03±15.90** 72.07±6.53** 地塞米松 0.001 117.47±4.30*## 2.21±0.09*## 701.02±25.52**## 70.59±2.25**# 芒果三芪肺纤方 5.00 129.18±2.53## 2.12±0.08## 630.24±32.41## 42.59±2.31## 3.30 114.21±1.34*# 2.25±0.05*# 665.02±21.13**## 42.89±1.23## 1.65 110.08±2.04*# 2.29±0.07 674.07±20.05**## 43.82±3.78## 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below

表 1 各组小鼠肺组织中SOD活力、MDA、HYP和IL-1β水平比较(x±s, n=10) Table 1 Comparison on activity of SOD, level of MDA, HYP, and IL-1β in lung tissue of mice (x±s, n=10)

光学显微镜下观察，对照组肺结构清晰，肺泡上皮细胞、肺间质血管上皮细胞未见或少见炎症细胞浸润，支气管、肺泡、血管壁均未见胶原纤维明显增生；肺泡炎症与肺纤维化程度评分均为0分；模型组小鼠均有肺泡炎，表现为肺泡充血、水肿，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮细胞有中至重度损伤，肺泡炎稍减轻；肺纤维化程度最重，多呈III级肺纤维化变化，胶原纤维组织增生、变厚，肺气肿严重；肺泡炎症与肺纤维化程度评分均为3分，与对照组比较，差异显著（P＜0.01）。各给药组肺泡炎症与肺纤维化程度均有明显的改善，评分均为2分，与模型组比较，差异显著（P＜0.01）。肺组织病理学分析结果见图 1、2和表 2。

图 1 各组小鼠肺组织HE染色 Fig. 1 Pathological observation on HE staining of lung in mice

图 2 各组小鼠肺组织Masson染色 Fig. 2 Pathological observation on Masson staining of lung in mice

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠肺泡炎症、肺纤维化程度比较(x±s, n=10) Table 2 Comparison on lung inflammation and pulmonary fibrosis in lung tissue of mice (x±s, n=10) 组别 剂量/ (g∙kg−1) 肺泡炎症 （HE） 肺纤维化 （Masson） 对照 — 0 0 模型 — 3** 3** 地塞米松 0.001 2** 2** 芒果三芪肺纤方 5.00 2** 2** 3.30 2** 2** 1.65 2** 2**

表 2 各组小鼠肺泡炎症、肺纤维化程度比较(x±s, n=10) Table 2 Comparison on lung inflammation and pulmonary fibrosis in lung tissue of mice (x±s, n=10)

本实验芒果三芪肺纤方显著提高模型小鼠体内SOD活力、降低MDA水平，说明本方能增加氧自由基清除能力，降低氧自由基代谢产物的损害，对博莱霉素致小鼠肺损伤具有保护作用，从而抑制肺纤维化。各组HYP测定结果表明，给药组均能显著地降低HYP水平，芒果三芪肺纤方组HYP水平甚至达到对照组水平，表明其可以通过抑制胶原蛋白的形成，减轻肺纤维化的程度。通过ELISA测定各组肺匀浆中IL-1β水平，可知模型组在疾病发展过程中IL-1β水平始终偏高，而给药组明显降低，表明其可能通过抑制IL-1β的表达而发挥抑制肺纤维化形成的作用。实验结果表明此方可以抗氧化、抗自由基损伤；抑制炎症因子的释放，发挥抗炎性损伤作用；影响胶原的代谢而减少肺纤维蛋白的形成，进而发挥抑制肺纤维化的作用。

肺纤维化难以用单一病机来解释，很多医家认为：肺纤维化当属本虚标实，以肺肾气虚为本，以痰浊、瘀血、热毒等邪实内阻为标^[12-13]。在本病的发生、发展的整个过程中，正气不足是本病之本，“虚”“痰”“瘀”一直贯穿于疾病的始终。单味中药对肺纤维化的作用具有局限性，难以完全治疗病机复杂的疾病，中药复方才是中药研究的重难点。目前中医用药多以补益药和活血药为主，以祛痰药为佐。芒果三芪肺纤方所选药物黄芪多糖、芒果苷、三七总皂苷分别是中药黄芪、芒果叶、三七中重要的有效成分，已有实验表明黄芪、芒果叶、三七对肺纤维化或呼吸系统疾病有一定的治疗作用^[14-17]。本实验采用方剂配伍中的有效组分配伍方法展开研究，其中黄芪多糖为补虚扶正之药，芒果苷为消炎止咳化痰之药，三七总皂苷为活血化瘀之药。此方是根据中医“辨证论治”的思想，合理用药，以求达标本皆治之效。而且此方组成药物较少，针对性强，有利于实验研究。