2016, Vol. 39
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.05.009 |
2. 上海国宝企业发展中心, 上海 200001
2. Shanghai GuoBao Enterprise Development Center, Shanghai 200001, China
肺纤维化是多种肺部病变导致肺泡持续性损伤及细胞外基质反复破坏，肺组织变硬、变厚，肺脏交换氧气进入血液的能力逐步丧失的一种疾病[1-2]。临床诊断明确后5年生存率不足50%，而且近10年来发病率及病死率皆有升高[3]，肺纤维化严重影响病人的工作、生活。临床上对肺纤维化的治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂药物为主，作用有限且多存在严重的副作用[4-5]。积极探索新的治疗途径或新的药物已成为肺纤维化治疗亟待解决的问题。
冬虫夏草具有预防肺纤维化的作用，其主要通过抑制炎症细胞浸润活化及抗氧化来抑制肺纤维化进程[6]。冬虫夏草资源严重匮乏，价格极其昂贵，难以进行大量应用[7]。北冬虫夏草已实现人工大规模栽培，解决了原料的问题。虫草素是虫草中特有的活性成分，北冬虫夏草中其质量分数为2.4%，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节以及抗支气管哮喘等多种药理作用，近年来，其潜在开发应用价值已引起世界的高度重视。本课题组对虫草素制剂抗百草枯致大鼠肺纤维化作用进行了研究，现将结果报道如下。
1 材料与方法 1.1 药品和试剂虫草素制剂（批号140911，虫草素质量分数≥99%，散剂，100 g/袋）、虫草活力素A、B（批号140911，虫草素质量分数为2.4%，散剂，100 g/袋），均购于上海国宝企业发展中心；地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，生产批号13102851）；百草枯（山东省潍坊鸿汇化工有限公司，生产批号20140630）；大鼠羟脯氨酸（HYP）酶联免疫检测试剂盒、快速Masson染液（南京建成科技有限公司）。
1.2 仪器T10 basic匀浆机（德国IKA公司）；Centrifuge EPPENDORF 5810R离心机（德国EPPENDORF公司）；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪（中国Thermo scientific公司）；Eclipse Ti显微镜及拍摄软件（日本Nikon公司）。
1.3 动物SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购自上海普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2012-0002。
1.4 模型的制备及分组给药90只健康雄性SD大鼠随机分为8组：对照组，模型组，地塞米松（阳性药，1 mg/kg）组，虫草素制剂低、中、高剂量（125、250、500 mg/kg，500 mg/kg为临床等效剂量）组，虫草活力素A（500 mg/kg）组，虫草活力素B（500 mg/kg）组，模型组20只，其余各组每组10只。除对照组外，其余各组于实验第1天ip给予百草枯溶液17 mg/kg，给药体积为2 mL/kg，1次染毒。于第1天开始给药，地塞米松为ip给药，虫草制剂和虫草活力素为ig给药，对照组和模型组ig等体积的生理盐水，连续给药30 d。
1.5 指标检测于实验第1、2、3、4、6、8、10、12、16、19、23、26、30天（记为d1～d30）称体质量，记录动物一般状况、死亡情况。
于实验第31天，麻醉后处死动物，解剖，观察动物肺脏大体情况，将右肺下页结扎后取下。称质量，按0.1 g/mL的比例加入生理盐水，冰浴下匀浆，4 ℃、2 000 r/min离心15 min，取上清，分装冻存。ELISA法检测HYP水平，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。
剩下的肺组织，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，进行Masson染色。显微镜下观察组织病理学变化并拍照。
1.6 统计学处理采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学处理，计量资料均以x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 对肺纤维化大鼠存活及体质量的影响从第2天开始，给予百草枯的各组动物均开始出现死亡，各组死亡数不同，模型组死亡动物出现最早，且死亡动物数最多，死亡率为45%；至第12天不再出现动物死亡，实验结束时，地塞米松组、虫草素制剂低剂量组、虫草活力素A存活动物6只，死亡率为40%；虫草素制剂中、高剂量组，虫草活力素A存活动物8只，死亡率为20%。结果见表 1。
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表 1 虫草素对百草枯致肺纤维化大鼠存活动物数的影响 Table 1 Effect of cordycepin preparation on survival number of rats with pulmonary fibrosis induced by gramoxone |
对照组动物体质量增加明显，而给药组和模型组在给予百草枯后，所有动物体质量均出现了不同程度下降。d4～d10，模型组和虫草素制剂及虫草活力素A、B组动物体质量达到了最低值；特别是第d6～d8，模型组、虫草素制剂及虫草活力素A、B组与对照组比较，体质量差异显著（P＜0.01），且部分动物口鼻处见血性分泌物，状态萎靡，毛发略有竖立；随着给药时间的延长，从d12开始，动物体质量开始恢复增长，增长幅度略小于对照组，各组动物体质量增长幅度相似。
地塞米松组动物体质量最低，且恢复最缓慢，d19是动物体质量最低值，至实验结束，地塞米松组动物体质量与对照组比较仍差异显著（P＜0.01）。
虫草素制剂、虫草活力素A及虫草活力素B组给药后，动物状态均有改善，口鼻处有血性分泌物的动物明显减少。虫草活力素A组动物体质量下降较晚，至实验结束，恢复程度最好。虫草素制剂组动物体质量较地塞米松组稍高，实验结束时高、低剂量与模型组比较，差异不显著，结果见表 2。
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表 2 虫草素对百草枯致大鼠肺纤维化动物体质量的影响 Table 2 Effect of cordycepin preparation on weight of rats with pulmonary fibrosis induced by gramoxone |
2.2 对肺纤维化大鼠肺组织中HYP水平的影响
模型组大鼠HYP水平显著高于对照组（P＜0.01），给予药物治疗后，HYP水平不同程度下降，地塞米松组HYP水平为71.23 nmol/L，与模型组比较，差异显著（P＜0.05）；虫草素制剂各个剂量组HYP水平较模型组均有不同程度下降，高剂量组与模型组比较差异显著（P＜0.01）。虫草活力素A和B组HYP水平显著低于模型组（P＜0.01）。结果见表 3。
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表 3 虫草素对肺纤维化大鼠肺羟脯氨酸水平的影响 Table 3 Effect of cordycepin preparation on HYP content in lung tissue of rats with pulmonary fibrosis induced by gramoxone |
2.3 对肺纤维化大鼠肺部病理变化的影响
Masson染色结果显示：正常肺组织染色呈红色，镜下很少见到着色深蓝的纤维化组织，肺泡结构正常；模型组大鼠肺脏布满着深蓝色的纤维化组织，肺泡结构破坏严重，肺组织有部分实变；1 mg/kg的地塞米松组和500 mg/kg虫草素制剂组以及虫草活力素A、B组均不同程度的减少了纤维化组织，与模型组比较，纤维化程度略有缓和。结果见图 1。
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图 1 虫草素对百草枯致大鼠肺纤维化肺组织masson染色照片 Fig. 1 Masson staining photos of cordycepin preparation on lung tissue of rats with pulmonary fibrosis induced by gramoxone |
3 讨论
吸烟、遗传、传染病及一些处方药均可导致肺纤维化，特别是随着环境污染的加剧，该病的发病率近年来显著增加[8]。肺纤维化的治疗成为亟待解决的问题。然而，肺纤维化治疗比较困难。特发性肺纤维化（IPF）是最难治的慢性纤维化肺部疾病，其死亡率甚至超过许多癌症[9]。因此，近年来防治肺纤维化的研究已成为科学界关注的热点。
冬虫夏草是我国名贵中药材，具有多种功效，虫草素作为冬虫夏草的活性成分也具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血脂等多种药理活性[11]。虫草素的化学名称为3’-脱氧腺苷（3’-deoxy-adenosine），溶于水、乙醇和甲醇，不溶于苯、丁醚和氯仿[12]。本研究用百草枯诱导大鼠肺纤维化模型，测试样品虫草素制剂对百草枯致大鼠肺纤维化的治疗作用。结果发现，虫草素制剂能有效降低百草枯致大鼠肺纤维化动物肺组织中HYP水平，改善肺的组织结构和纤维化病理变化。为虫草素进一步开发为抗肺纤维化药物提供一定的理论基础。
高剂量虫草素制剂和虫草活力素A、B能降低百草枯ip给药导致的大鼠肺纤维化程度，降低肺匀浆中HYP水平，具有一定程度的抗大鼠肺纤维化作用。
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