2016, Vol. 39
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.05.008 |
2. 吉林大学药学院, 吉林 长春 130021;
3. 吉林大学临床医学院, 吉林 长春 130021
, WANG Yu-chen3, GUAN Xue-wa1, PANG Zhi-qiang2, LU Yan-jiao1, WANG Guo-qiang1, ZHENG Jing-tong1, ZHU Hai-lin2, WANG Fang1
2. School of Pharmaceutical Science, Jilin University, Changchun 130021, China ;
3. School of Clinical Medicine, Jilin University, Changchun 130021, China
毛酸浆Physalis pubescens L.为茄科（Solanaceae）酸浆属Physalis L.的一年生草本植物，始载于《神农本草经》，列为中品。其带浆果的宿萼或全草称为灯笼草，具有清热解毒、化痰利尿的作用，是常用的清热解毒药[1-2]。随着分离纯化技术的发展，近年来对其化学成分的分析已经取得了长足的进步，贾远敏等[3]相继分离得到了3, 7, 3′-三甲基槲皮素等多种单体化合物，本课题组朱海林等[4]分离得到反式对羟基肉桂酸乙酯等9个化合物。另有研究表明从毛酸浆中分离纯化得到的化合物Physapubescin B能够使肿瘤细胞复制停留在G2/M期，从而对人前列腺癌具有良好的抗肿瘤活性[5]。
本课题组前期对毛酸浆的利尿及抗菌活性进行了探讨[6-7]，但迄今为止未见毛酸浆果对于炎症反应影响作用的研究报道。因此，本课题组建立了动物及细胞炎症模型，观察毛酸浆果80%乙醇提取物（Alcohol Extract of the Fruit of Physalis pubescens L.，AEFPP）对小鼠离体巨噬细胞及炎症模型动物的抗炎作用，并初步探讨其机制。
1 材料 1.1 实验动物清洁级雄性Balb/c健康小鼠50只，体质量18～25 g；清洁级雄性Wistar大鼠50只，体质量240～280 g；均购自吉林大学白求恩医学部基础实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（吉）-2013-0001。
1.2 细胞小鼠RAW 264.7单核巨噬细胞，吉林大学基础医学院生物化学实验室惠赠，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，置于5% CO2、37 ℃培养箱中进行常规培养。
1.3 药物与主要试剂AEFPP由吉林大学药学院再生所新药研究室提供，其带宿萼果实于2014年9月采摘自吉林省吉林市，由吉林大学李平亚教授鉴定为茄科酸浆属植物毛酸浆Physalis pubescens L.的带宿萼果实。通过10倍体积的80%乙醇室温浸泡3次后合并提取液，通过真空干燥、粉碎得粉末。AEFPP中含有大量的苷类成分，通过定量测定，其中木犀草苷质量分数为0.1%。
蒲地蓝消炎片（广东国医堂制药股份有限公司，批号150801）；DMEM培养液（美国Gibco公司）；FBS（澳大利亚Gibco公司）；脂多糖（LPS，批号032M4082V，美国Sigma公司）；TNF-α ELISA试剂盒（美国Ray Biotech公司）；IL-6 ELISA试剂盒（联科生物技术有限公司）；逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；实时定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（瑞士Roche公司）；NF-κB p65抗体（英国abcam公司）；其他化学试剂均为分析纯。
1.4 主要仪器SW-CJ-2F细胞超净工作台（苏净集团安泰空气技术有限公司）；SANYO MCO-18AIC CO2培养箱（武汉爱斯佩科学仪器有限公司）；TECAN SUNRIS微孔板分光光度计（北京早稻田生物科技发展有限公司）；ABI 7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI生物公司）；EPS 300电泳仪（上海天能科技有限公司）。
2 方法 2.1 小鼠耳廓肿胀实验取雄性Balb/c小鼠50只，适应性饲养3 d后禁食12 h后称体质量，按体质量随机分为5组：模型组（双蒸水），AEFPP低、中、高剂量（0.2、0.4、0.8 g/kg，参照《中国药典》[8]中关于对毛酸浆同属植物锦灯笼的推荐给药剂量，同时结合预实验结果设置）组和蒲地蓝消炎片（阳性药，1.5 g/kg）组，每组10只。每天ig给药1次，连续给药7 d，给药体积均为20 mL/kg。末次给药前12 h禁食，称体质量。并于末次给药1 h后，定量汲取二甲苯20 μL，滴加在小鼠右耳外侧面耳廓的中央，让其自由扩散，左耳作为对照。30 min后，将小鼠颈椎脱臼处死，用9 mm直径打孔器在耳廓相同部位打孔，电子天平称两耳片质量，以两耳质量之差为耳廓肿胀度，计算耳肿胀抑制率。
耳廓肿胀度＝右耳片质量－左耳片质量
耳肿胀抑制率＝（模型组肿胀度－给药组肿胀度）/模型组肿胀度
2.2 大鼠棉球肉芽肿实验取雄性Wistar大鼠50只，适应性饲养3 d禁食12 h后称体质量。3%戊巴比妥钠溶液ip麻醉（45 mg/kg），用剃毛器剃去大鼠两侧腹股沟处的毛，酒精棉消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤后植入20 mg已干燥灭菌的紧致小棉球，缝合切口。术后随机分5组：模型组（双蒸水），AEFPP高、中、低剂量（0.1、0.2、0.4 g/kg）组和蒲地蓝消炎片（0.9 g/kg）组，每组10只。从手术当天开始ig给药7 d，每天1次，给药体积均为20 mL/kg。第7天禁食，次日，称体质量后断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，取出棉球剔除脂肪组织，置于60 ℃恒温干燥箱，3 h后称重。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿质量，计算肉芽肿抑制率。
肉芽肿抑制率＝（模型组肉芽肿质量－给药组肉芽肿质量）/模型组肉芽肿质量
2.3 细胞培养RAW 264.7单核巨噬细胞，用含10% FBS的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2条件下传代培养，取对数生长期细胞进行实验。
2.4 MTT法检测细胞毒性收集对数生长期RAW 264.7细胞，调整密度为每孔1×105个，接种于96孔培养板中，每孔100 μL。待细胞贴壁后，吸弃各孔培养液，更换用DMEM维持液稀释的AEFPP，质量浓度分别为20.00、15.00、10.00、5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL，对照组加入DMEM维持液，空白组为不含细胞的DMEM维持液，每孔100 μL，每组设置10个平行孔。培养21 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃、5% CO2条件下继续孵育4 h后，吸弃孔内液体，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，使细胞内结晶充分溶解，微孔板分光光度计于490 nm波长处检测各孔吸光度（A）值，计算细胞活性以评价细胞毒性。
细胞活性＝（AEFPP组A值－空白组A值）/（对照组A值－空白组A值）
2.5 ELISA法检测细胞中TNF-α、IL-6水平收集对数生长期RAW 264.7细胞，调整密度为1×106个/孔，接种于6孔培养板中，每孔2 mL，待细胞贴壁后，吸弃各孔培养液，更换为DMEM维持液，随机分为5组：模型组（加入终质量浓度为1 mg/L的LPS溶液），AEFPP高、中、低剂量组（加入终质量浓度分别为0.625、1.250、2.500 mg/mL的AEFPP溶液预处理3 h后加入1 mg/L LPS溶液）和对照组（加入等量的DMEM维持液2 mL），每孔设10个平行孔。继续培养18 h后，收集各孔中的RAW 264.7细胞上清液，检测TNF-α和IL-6水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，根据标准曲线，计算各组上清液TNF-α和IL-6水平。
2.6 qRT-PCR法检测NF-κB p65 mRNA表达取“2.5”项已收集上清后的细胞，采用Trizol法提取各组细胞中的总RNA，使用PrimeScript TM RT Reagent Kit试剂盒逆转录为cDNA，然后使用Fast Start Universal SYBR Green Master试剂盒，采用qRT-PCR法检测NF-κB p65 mRNA的表达水平。记录反应后的Ct值，采用2−ΔΔCt法计算基因的表达水平。引物序列设计见表 1。
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表 1 Real Time-PCR引物序列 Table 1 Primer sequences of Real Time-PCR |
2.7 Western blotting法检测NF-κB p65蛋白表达
取“2.5”项已收集上清后的RAW 264.7细胞，加入RIPA细胞裂解液充分裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离样品，电转移至PVDF膜，5% BSA液封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育2 h，再次洗膜、显影，以目的条带与β-actin A值的比值作为蛋白表达相对水平。采用Image J2x 2.1.4.7软件进行灰度值分析。
2.8 统计学处理实验数据用x±s表示，采用SPSS 21.0软件进行统计分析，两组间均数进行t检验，多组间均数进行单因素方差分析。
3 结果 3.1 对大鼠、小鼠体质量的影响根据表 2、3中数据，单因素方差分析多个实验组之间的体质量差异，表明各组实验鼠初始体质量之间差异不显著，显示分组的随机性良好；实验结束时，各组体质量增长基本相似；对各剂量组大鼠、小鼠体质量及其增长值进行方差齐性检验，满足方差齐的要求；单因素方差分析表明，各组大鼠、小鼠末期体质量及体质量增长值之间差异不显著，表明不同的给药剂量不会对大鼠、小鼠的体质量造成影响。
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表 2 AEFPP对小鼠体质量的影响(x±s, n=10) Table 2 Effects of AEFPP on the body weight of the mice (x±s, n=10) |
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表 3 AEFPP对大鼠体质量的影响(x±s, n=10) Table 3 Effects of AEFPP on the body weight of the rats (x±s, n=10) |
3.2 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
与模型组比较，AEFPP高剂量组显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀（P＜0.05），而低、中剂量组耳廓肿胀差异不显著；蒲地蓝消炎片对二甲苯致小鼠耳廓肿胀抑制作用显著（P＜0.05）。进行相关性分析表明，小鼠耳廓肿胀抑制率与给药剂量之间存在良好的线性相关关系（P＜0.05，R2＝0.9271），结果见表 4。
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表 4 AEFPP对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(x±s, n=10) Table 4 Effects of AEFPP on ear edema induced by dimethyl benzene in mice (x±s, n=10) |
3.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响
与模型组比较，AEFPP中、高剂量均能显著抑制大鼠棉球肉芽肿增生（P＜0.05、0.01）。蒲地蓝消炎片对大鼠棉球肉芽肿也具有显著抑制作用（P＜0.01）。结果见表 5。
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表 5 AEFPP对大鼠棉球肉芽肿的影响(x±s, n=10) Table 5 Effects of AEFPP on granuloma induced by cotton pellet implantation (x±s, n=10) |
3.4 对RAW 264.7细胞毒性作用
MTT细胞毒性实验结果显示，在上述10个不同质量浓度中，0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mg/L的AEFPP的水溶液作用于RAW 264.7细胞21 h后，细胞活性与对照组比较差异不显著。表明AEFPP在0～3 mg/mL对细胞无明显毒性。结果见表 6。选取0.625、1.250、2.500 mg/L的AEFPP作为细胞实验给药浓度。
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表 6 不同浓度AEFPP对RAW 264.7细胞活性的作用(x±s, n=10) Table 6 Effects of different concentration of AEFPP on the cell viability (x±s, n=10) |
3.5 对LPS作用下RAW 264.7细胞中TNF-α、IL-6水平的影响
与对照组比较，模型组细胞培养液中的TNF-α、IL-6水平均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，AEFPP各剂量组细胞中TNF-α、IL-6水平均显著降低（P＜0.01、0.001）。结果见表 7。
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表 7 AEFPP对细胞上清液TNF-α、IL-6水平的影响(x±s, n=10) Table 7 Effects of AEFPP on the content of TNF-α and IL-6 in the supernatant (x±s, n=10) |
3.6 对LPS作用下RAW 264.7细胞NF-κB p65 mRNA的表达水平的影响
与对照组比较，模型组细胞NF-κB p65 mRNA表达显著上调（P＜0.001）；与模型组比较，AEFPP低、中、高剂量组均能显著抑制NF-κB p65基因的表达（P＜0.001）。结果见图 2。
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与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001 ###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 vs model group 图 2 AEFPP对LPS作用下RAW 264.7细胞NF-κB p65 mRNA表达的影响(x±s, n=10) Fig. 2 Effects of AEFPP on the expression levels of NF-κB p65 mRNA in LPS-stimulated RAW 264.7 cells (x±s, n=10) |
3.7 对LPS作用下RAW 264.7细胞NF-κB p65蛋白的表达水平的影响
如图 3所示，与对照组比较，模型组NF-κB p65蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AEFPP低、中剂量组NF-κB p65蛋白表达显著降低（P＜0.05），而高剂量组没有显著变化。
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与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：P＜0.05 #P < 0.05 vs control group; P < 0.05 vs model group 图 3 AEFPP对LPS作用下RAW 264.7细胞NF-κB p65蛋白表达的影响(x±s, n=10) Fig. 3 Effects of AEFPP on the expression levels of NF-κB p65 protein in LPS-stimulated RAW 264.7 cells (x±s, n=10) |
4 讨论
毛酸浆果实作为一种新型的药用食品，近来已越来越成为关注的热点[9-11]。并且以毛酸浆为原料加工生产出的果汁、罐头、果冻、果酱和果脯受到日、韩等国及国内消费者的青睐，市场发展前景广阔[12]。然而作为中国东北地区的道地药材，民间广泛用于治疗咽喉肿痛的毛酸浆，在抗炎机制方面鲜有研究。故本研究通过复制炎症模型，观察AEFPP的抗炎作用并初步探讨其机制。
在众多细胞炎症模型中，小鼠单核巨噬细胞株RAW 264.7是最常用的细胞株[13-14]。LPS是革兰阴性菌的细胞壁主要组成成分，单核巨噬细胞受到LPS刺激后，激活MAPK和NF-κB等信号转导通路，进而促进TNF-α、IL-6和IL-8等炎症细胞因子的表达，引起炎症反应[15-16]。p65蛋白作为NF-κB通路中的关键组分，在炎症的发生发展过程中发挥着重要的作用[17]。本研究结果显示，AEFPP可以显著抑制p65蛋白的表达，降低LPS诱导RAW 264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6的释放，提示AEFPP可能通过下调NF-κB p65蛋白的表达、减少这些炎症因子的释放，进而发挥抗炎作用。同时，实验结果显示，高剂量组与低、中剂量组比较，其抗炎作用效果不佳，推测可能是因为此时对于NF-κB通路的作用已经达到饱和，同时还激活了其他未知的信号通路或者同时产生了其他方面的显著影响，造成抗炎作用减弱，但其具体机制尚有待于进一步研究。
为进一步观察AEFPP的动物个体抗炎作用，本研究建立了二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀模型和大鼠棉球肉芽肿模型。二甲苯可促进组胺和激肽等炎症介质释放，引起炎症细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿[18]。棉球刺激可引起结缔组织的增长，造成炎症。研究结果显示，AEFPP高剂量组可显著抑制小鼠耳廓肿胀率，高、中、低剂量均能显著抑制大鼠棉球肉芽肿增生，且具有一定的剂量依赖性。表明AEFPP具有较好的抗炎作用。
综上所述，AEFPP具有较好的抗炎活性，作用机制可能与下调NF-κB p65基因和蛋白的表达以及抑制炎症因子IL-6、TNF-α的释放有关，但其具体作用机制还有待进一步完善。
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