多烯紫杉醇（docetaxel，DTX）是紫杉烷类的新一代半合成抗癌药，结构见图 1（a）。在临床试验中，多烯紫杉醇已经被成功应用，主要是用于治疗卵巢癌、乳腺癌后期，肺癌和头/颈癌^[1-4]。但是多烯紫杉醇亲脂性高，不溶于水，口服吸收效果不佳，且不稳定，生物利用度低。纳米粒具有易制备、载体材料多样性、载药量高、生物利用度高、缓控释、可靶向给药等特点，受到越来越多的关注^[5-6]。因此，可以将多烯紫杉醇制备成纳米粒，以期提高其溶解度和生物利用度。载体材料的选择是制备纳米粒的关键，其通常由天然高分子材料和合成高分子材料两大类组成，合成高分子载体材料更能接近应用要求，越来越受人们的青睐。研究发现，以四代的聚酰胺-胺（polyamidoamine，PAMAM）树形分子为内核，以25%的偶联效率接枝的二代三乙二醇树枝化基元寡聚乙二醇（OEG）为外壳[图 1（b）]的新型两亲性树状大分子（PAMAM-co-0.25OEG，PGD）具有稳定性高、载药空腔大的优点，对于多种难溶性药物均有较好的装载能力^[7-8]。此新型树状大分子不仅可以用于制备载药胶束，还可作为稳定剂制备纳米粒。由此，选用这一新型载体材料作为稳定剂制备多烯紫杉醇纳米粒，以期提高多烯紫杉醇溶解度和生物利用度，并对其进行体外特征及细胞毒作用的研究。

图 1 多烯紫杉醇（a）及PGD（b）分子结构 Fig. 1 Molecular structure of DTX (a) and PGD (b)

KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DGG-9030AD型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；Meppler Toledo AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Purelab Classic综合纯水仪（英国ELGA公司）；Zetasizer Nano ZS 90（马尔文仪器有限公司）；Ultimate 3000 Series高效液相色谱仪（Dionex）；Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司）；S-4800场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（日本日立公司）；Mettler TGA/DSC 1 SF/1382热重分析仪（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DX-2700型X-射线衍射仪（日本理学电机株式会社）；JN-3000 PLUS高压均质机（广州聚能生物科技有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（金坛国旺实验仪器厂）；MCA-15AC细胞培养箱（日本Sanyo公司）；UQuant酶标仪（美国Biotek仪器公司）。

多烯紫杉醇（docetaxel，DTX），相对分子质量807.88，购自北京偶合科技有限公司；PGD聚合物，相对分子质量4.6×10⁴，由实验室合成；乙腈（批号A3889，Fisher，色谱纯）；其他试剂均为分析纯。

Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%的冰醋酸-乙腈（35׃65)；体积流量0.8 mL/min；检测波长230 nm；温度25℃；进样量20 μL。

配制DTX的甲醇溶液，质量浓度分别为100、50、25、10、5、1、0.5 μg/mL，在2.1.1色谱条件下测定峰面积。以峰面积对质量浓度（μg/mL）进行线性回归，得DTX标准曲线。

纳米粒的制备采用溶剂沉淀法联合高压均质法。室温下，称取聚合物PGD（2 mg）与DTX（16 mg）共同溶解于N, N-二甲基甲酰胺（DMF）（1 mL）中，25 ℃、250 W超声条件下注入去离子水（10 mL）中，继续超声10 min，室温条件下用去离子水透析4 h（1 L/h），1.8×10⁵ kPa高压均质20次，得到DTX-PGD纳米粒。

动态光散射测定载药纳米粒粒径及电位，以平均粒径及Zeta电位记录测定结果，并以HPLC测定其载药量（drug loading capacity，DL%）。

测定方法：取纳米粒5 mL，冷冻干燥后称质量，质量记为W₁。用甲醇溶解并定容到25 mL，按照2.1.1的色谱条件测定DTX浓度，计算纳米粒中DTX总量，记为W₂。根据载药量公式计算DL%。

DL%＝W₂/W₁

纳米粒的粒径稳定性考察DTX-PGD纳米粒分别与等体积0.9%生理盐水、5%葡萄糖、PBS及血浆混合，37 ℃孵育，于0、2、4、6 h测其粒径大小，观察有无沉淀或浑浊，并以不同时间点的粒径大小对时间作图，评价DTX-PGD纳米粒在0.9%生理盐水、5%葡萄糖、PBS及血浆中的粒径稳定性。

纳米粒的扫描电镜观察制备纳米粒后，冻干，涂覆金6 min后，通过扫描电镜观察并拍照，加速电压为30 mV。

使用DX-2700型X射线衍射仪，在管压40 kV，管流40 MA，Cu靶，扫描速度为10 ℃/min，扫描范围为3～40 ℃，步宽0.02。分别检测DTX、DTX与PGD物理混合物、DTX-PGD纳米粒冻干粉的晶型。

精密吸取1 mL将制备好的DTX-PGD纳米粒（1 mg/mL满足漏槽条件），装入经蒸馏水浸泡处理过的透析袋（相对分子质量14 000）内，将袋口扎紧，以50 mL的PBS＋0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）组成的释放介质，在37 ℃水浴恒温搅拌（100 r/min）。在预设时间点（0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144、168 h）取样5 mL，按照2.1.1的色谱条件，HPLC法测其中的药物含量，同时补加同体积的释放外液，每24 h换液1次。将所取样品10 000 r/min离心10 min后，取上清液相测定释放介质中DTX的含量，计算累计释放率（实验平行3份），绘制体外释放曲线。

分别取不同质量浓度（1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL）DTX-PGD纳米粒的葡萄糖等渗液500 μL与500 μL红细胞悬浮液（红细胞浓度为4%）混合后37 ℃孵育4 h，5 000 r/min离心5 min，取上清150 μL于96孔板中，用酶标仪在540 nm测紫外吸光度（A）值，每个浓度平行3份，以葡萄糖为阴性对照，以蒸馏水为阳性对照。计算溶血率。

溶血率=（实验组的A值－阴性对照组A值）/（阳性对照组A值－阴性对照组的A值）

培养4T1细胞至对数期，按8.0×10³/孔，37 ℃、5%CO₂培养24 h，质量浓度为1.6 mg/mL的DTX-PGD纳米粒，用不含胎牛血清的1640培养基将纳米粒稀释成0.1、1、5、10、50 μg/mL，每个质量浓度平行给药6组，孵育48 h，后加入MTT 20 μL/孔，孵育4 h，吸出各孔液体，每孔加入DMSO 200 μL，震荡15 min，使蓝紫色结晶物充分溶解。在酶联免疫荧光仪上检测570 nm下的A值，计算细胞存活率。

细胞存活率=（药物组每孔A均值−空白组A值）/（对照组A均值−空白组A值）

2.1.1的色谱条件下，DTX保留时间在5.84 min左右。其含量测定的最低检测限为0.1 μg/mL，最低定量限为0.5 μg/mL。以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，得到标准曲线方程：A＝0.410 4 C＋0.019 6（R²=0.999 9）。结果表明，DTX在0.5～100 μg/mL内峰面积与质量浓度的线性关系良好。

采用溶剂沉淀法联合高压均质制备得到的DTX-PGD纳米粒为乳白色溶液，DLS测得粒径为（270.7±3.0）nm（PDI值为0.112±0.070），电位（28.6±2.8）mV。由图 2的粒径分布图可以看出，DTX-PGD纳米粒粒径分布为单峰，说明纳米粒粒径分布较为集中，分散较为均匀。DTX-PGD纳米粒载药量高达（65.7±1.9）%，DTX药物溶解度增加至1.6 mg/mL，即将DTX制备成纳米粒，有助于提高DTX在水中的溶解度。

图 2 DTX-PGD纳米粒的粒径 Fig. 2 Particle size distribution of DTX-PGD nanoparticles

DTX-PGD纳米粒在0.9%生理盐水及PBS中不稳定，在5%葡萄糖及血浆中稳定。考察结果见图 3，6 h之内，DTX-PGD纳米粒在葡萄糖和血浆中的粒径无明显变化。肉眼观察，DTX-PGD纳米粒溶液在葡萄糖和血浆中也无明显沉淀或浑浊现象。证明纳米粒在葡萄糖中能稳定存在。纳米粒必须以等渗状态入血才可选择静脉注射给药方式，因此，DTX-PGD纳米粒在葡萄糖等渗溶液中的稳定性为其静脉注射给药提供了可能。

图 3 DTX-PGD纳米粒在葡萄糖及血浆中的粒径稳定性考察（n=3） Fig. 3 Particle size stability of DTX-PGD nanoparticles in glucose and plasma (n=3)

DTX原粉和DTX-PGD纳米粒冻干粉喷金后在扫描电子显微镜下观察形态见图 4（a为DTX原粉，b为DTX-PGD纳米粒）。由电镜照片可见，DTX原粉为微米级片状，粒径约1 μm；DTX-PGD纳米粒呈规则的片状，分布较为均匀，粒径在200 nm左右。由于SEM中测得为干粒子的粒径，而马尔文粒度仪测得的是粒子的水化半径，故SEM中显示的粒径较马尔文测得值偏小，此差异是由于测定方法不同造成的^[10]。

图 4 SEM观察DTX（a）和DTX-PGD纳米粒（b）的照片 Fig. 4 SEM images of DTX bulk powders (a) and DTX-PGD nanoparticles (b).

图 5为DTX原药、DTX与PGD物理混合物和DTX-PGD纳米粒的X射线衍射结果，DTX与PGD物理混合物和DTX-PGD纳米粒的X射线衍射曲线中均出现了DTX原药的8°、14°及26.5°位置的衍射峰。说明DTX药物是以晶型形式存在于DTX-PGD纳米粒中的。与无定形状态相比，纳米粒中多烯紫杉醇以晶型形式存在，可能更有助于药物的缓慢释放。

图 5 DTX原药、DTX与PGD物理混合物和DTX-PGD纳米粒的X射线衍射分析结果 Fig. 5 X-ray analysis of DTX bulk powders, mixture of DTX and PGD, and DTX-PGD nanoparticles

DTX-PGD纳米粒在PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4，含0.5%SDS）中能够缓慢释放。从图 6释放结果说明，DTX-PGD纳米粒释放分为两个阶段，24 h之内，纳米粒的释放几乎呈现零级释放状态，累积释放率45%左右。24 h以后，释放开始变慢，168 h释放70%。DTX的DMSO溶液24 h内释放较快，累积释放率达82%，24 h之后，释放变得较为缓慢，96 h释放完全。DTX原药的水溶液释放极为缓慢，168 h释放不到50%。

图 6 DTX-PGD纳米粒在PBS缓冲液中的释放率 Fig. 6 Release of DTX-PGD nanoparticles in PBS buffer

相对于DTX原溶液和粉末来说，DTX-PGD纳米粒体外缓释效果明显，这可能和DTX药物在纳米粒中以晶型形式存在有关。相对于无定形状态，药物以晶型态存在可能更有利于药物的缓慢释放。

表 1所示的溶血实验结果表明，1 mg/mL药物质量浓度下，溶血率为负值，小于5%^[11]。表明DTX-PGD纳米粒不溶血，适合静脉注射给药。

表 1(Table 1)

表 1 DTX-PGD纳米粒的溶血性考察（n=3） Table 1 Hemolysis of DTX-PGD nanoparticles (n=3) 组别 C/(mg·mL-1) A值 溶血率/% 阴性对照 — 0.291 — 阳性对照 — 0.795 — DTX-PGD纳米粒 1 0.259 −6.3 0.5 0.196 −18.8 0.25 0.181 −21.8 0.125 0.177 −22.6 0.0625 0.154 −27.2

表 1 DTX-PGD纳米粒的溶血性考察（n=3） Table 1 Hemolysis of DTX-PGD nanoparticles (n=3)

通过MTT法评价DTX-PGD纳米粒对4T1细胞的毒性，从IC₅₀值来看，纳米粒组对细胞杀伤作用较大，DTX溶液组IC₅₀值（9.498 μg/mL）是DTX纳米粒（3.862 μg/mL）的2.5倍。图 7可以看到，相比游离DTX，DTX-PGD纳米粒将会有更好的抗肿瘤效果，为进一步进行体内抗肿瘤药效实验奠定了基础。

图 7 DTX-PGD纳米粒及DTX溶液对4T1细胞48 h的杀伤作用 Fig. 7 Cytotoxicity of DTX-PGD nanoparticles and DTX solution against 4T1 cells for 48 h incubation

本研究以一种新型的树状大分子为载体制备了高载药量的DTX-PGD纳米粒，有效的提高了DTX在水中的溶解度，有助于其生物利用度的提高。DTX-PGD纳米粒呈片状，粒子为纳米大小，分布均匀，在5%葡萄糖、血浆中稳定性较好。DTX药物以晶型形式存在于纳米粒中，缓释效果明显。此纳米粒无溶血现象，适于静脉注射给药。DTX-PGD纳米粒对4T1细胞有较强的杀伤作用，其抑瘤效果更佳。但药物在动物体内的分布与代谢是一个非常复杂的过程，体外释放行为并不能完全代表其体内药动学行为，因此DTX-PGD纳米粒的体内代谢过程有待于进一步研究。