注射用硝酸异山梨酯为国家基本药物目录（2010年）收载的血管扩张药。硝酸异山梨酯主要的药理作用为松弛血管平滑肌，继而引起外周动脉和静脉回流，起到对静脉血管和冠状动脉的扩张作用。适用于急性心梗后继发左心室衰竭，各种不同病因所致左心室衰竭及严重或不稳定型心绞痛^[1-2]。依托国家药典委员会标准提高工作，本文建立了该品种有关物质检查的梯度HPLC法，不仅可满足质控需求，同时也为质量评价提供更具区分力的检测方法。

1 仪器与试药

Waters 2695型高效液相色谱仪、2996型PAD检测器（美国Waters公司），XP205型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

硝酸异山梨酯对照品（批号100250-200503，100.0%）、2-单硝酸异山梨酯对照品（批号100695-200401，100.0%）、单硝酸异山梨酯对照品（批号100694-200401，100.0%）均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇（HPLC级，Fisher Scientific），水（Millipore超纯水），盐酸（分析纯，北京化学试剂公司），氢氧化钠（分析纯，北京化学试剂公司），过氧化氢水溶液（分析纯，北京化学试剂公司）；注射用硝酸异山梨酯样品（共4批，①北京四环科宝制药有限公司，批号10092007；②长春国奥药业有限公司，批号20100301；③天津君安生物制药有限公司，批号20100101；④多菲制药（中国）有限公司，批号20110101）。

2 方法与结果 2.1 溶液的配制

供试品溶液的制备：取本品适量，精密称定，加甲醇-水（25׃75）溶解并定量稀释制成约含硝酸异山梨酯1 mg/mL的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

对照品储备溶液的制备：精密称取2-单硝酸异山梨酯对照品和单硝酸异山梨酯对照品各约10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水（25׃75）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。

对照溶液的制备：精密量取对照品储备溶液1 mL，置200 mL量瓶中，再精密加入供试品溶液1 mL，用甲醇-水（25׃75）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2 色谱条件

采用Agela Venusil MP C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以水-甲醇为流动相梯度洗脱（表 1），体积流量1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长为210 nm，进样量20 μL。

2.3 专属性考察 2.3.1 系统适用性试验

取“2.1”项下对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（图 1），2-单硝酸异山梨酯峰和单硝酸异山梨酯峰的分离度为2.8，同时考察了其他品牌的色谱柱，分离度均大于2.0，见表 2。

2.3.2 强制降解试验

储备液的制备：精密称取硝酸异山梨酯对照品100 mg，加溶剂溶解并稀释至20 mL，摇匀，即得。

酸降解溶液：量取储备液2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液1 mL，室温放置2 h，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液中和后，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

碱降解溶液：量取储备液2 mL，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，室温放置2 h，用0.1 mol/L盐酸溶液中和后，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

氧化降解溶液：量取储备液2 mL，置10 mL量瓶中，加30%过氧化氢溶液1 mL，室温放置1 h，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

热降解溶液：量取储备液2 mL，置10 mL量瓶中，水浴加热2 h，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

光降解溶液：量取储备液1 mL，置10 mL量瓶中，在强光下（4 500 lx）放置12 h，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

辅料溶液：取甘露醇与聚山梨酯80各适量，加溶剂溶解并定量稀释制成含甘露醇约30 mg/mL和聚山梨酯80约16 mg的混合溶液，作为辅料溶液。

取上述各降解溶液，注入液相色谱仪，典型色谱图见图 2，本品在热、酸和碱破坏条件下不稳定，除了不同程度地产生2-单硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯外，还检测了其他未知色谱峰。各降解产物与主成分均分离良好，且相邻色谱峰之间均能得到有效分离，表明该色谱系统专属性良好。

2.4 线性关系及校正因子

取2-单硝酸异山梨酯对照品、单硝酸异山梨酯对照品及硝酸异山梨酯对照品各适量，用溶剂溶解并定量稀释制成质量浓度分别为1.0232、1.1528、1.098 mg/mL的线性储备溶液；用溶剂分别定量稀释线性储备溶液，得到浓度百分数分别为10%、5%、1%、0.5%、0.2%的系列溶液，按“2.2”中的色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，以进样质量（μg）为横坐标作图，并进行线性回归。线性方程见表 3，2-单硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯标准曲线的斜率分别与硝酸异山梨酯标准曲线斜率的比值即为前二者的校正因子，见表 3。

2.5 最低检出限

取“2.4”项下0.2%标准曲线溶液，逐级稀释，进样测试，按信噪比（S/N）大于3，可作为最低检出限，结果测得2-单硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯和硝酸异山梨酯的检出限分别为6.2、6.9、3.4 ng。

2.6 精密度试验

取“2.5”项下0.5%线性溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯的峰面积的RSD分别为0.41%、0.22%、0.20%，表明仪器的精密度良好。

2.7 溶液稳定性

供试品溶液分别在室温条件下放置0、1、2、4、8、12 h进样测定，杂质个数及含量均无明显变化，主峰峰面积的RSD为1.08%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 样品测定

取本品，加甲醇-水（25׃75）使溶解并定量稀释制成约含硝酸异山梨酯1 mg/mL的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取2-单硝酸异山梨酯对照品和单异山梨酯对照品各适量，精密称定，加溶剂使解并定量稀释制成质量浓度各约1 mg/mL的混合溶液，精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，再精密加入供试品溶液1 mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。对照溶液中2-单硝酸异山梨酯峰和单硝酸异山梨酯峰的分离度应大于2.0。供试品溶液的色谱图中如有与2-单硝酸异山梨酯峰和单硝酸异山梨酯峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，均不得过硝酸异山梨酯标示量的0.5%，其他单个杂质峰的峰面积不得大于对照溶液中硝酸异山梨酯峰面积的0.5%，杂质总量不得超过1.0%。

采用上述梯度洗脱方法和中国药典^[3]硝酸异山梨酯有关物质检查项下的等度洗脱方法，分别测定4批注射用硝酸异山梨酯的有关物质，结果见表 4，供试品溶液典型色谱图见图 3。比较两种洗脱方式测定结果可以看出，在该梯度洗脱条件下，能检出更多的杂质，更真实地反映了各个企业产品的杂质控制水平。

3 讨论 3.1 流动相梯度洗脱程序

《中国药典》2015年版^[4]注射用硝酸异山梨酯有关物质检查，仍以甲醇-水（25׃75）为流动相等度洗脱，该方法可准确检测工艺杂质2-单硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯，对于制剂，其制备及放置过程均可能引入或产生其他有关物质^[5]，对此，本文在保证对工艺杂质检测能力的基础上，通过梯度变化来改变流动相的洗脱能力，以使更多杂质能被检测。同时，通过梯度洗脱，更有区分力地反映各个企业产品的杂质控制水平，为产品质量评价提供技术平台。

3.2 杂质校正因子的计算

根据文献^[6-8]及CDE电子刊物中对校正因子的计算，本研究利用五点标准曲线斜率比值确定了2-单硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨及硝酸异山梨酯之间的相对校正因子。通过计算，2-单硝酸异山梨相对于硝酸异山梨酯的校正因子为0.63，单硝酸异山梨相对于硝酸异山梨酯的校正因子为0.60。

3.3 杂质定量方法的多种选择

本文建立的测定方法采用杂质对照品外标法计算已知杂质2-单硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯的含量，采用自身对照法计算其他未知杂质的含量。在实际检验工作中，可能会遇到杂质对照品获取困难的问题，也可采用加校正因子的主成分外标法来计算杂质含量，既能保证杂质含量测定值准确可靠，又降低了质控对杂质对照品的依赖，同时也简化了溶液制备操作。