药物评价研究  2016, Vol. 39 Issue (3): 357-361
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.03.005
高梅, 曹冲, 汤连升, 马会, 张森, 朱春花. 毛蚶提取物的遗传毒性试验研究[J]. 药物评价与研究, 2016, 39(3): 357-361.
GAO Mei, CAO Chong, TANG Lian-sheng, MA Hui, ZHANG Sen, ZHU Chun-hua. Genotoxicity of extract from Arca subcrenata[J]. Drug Evaluation Research, 2016, 39(3): 357-361.
毛蚶提取物的遗传毒性试验研究
高梅, 曹冲, 汤连升, 马会, 张森, 朱春花     
山东省药学科学院, 山东省化学药物重点实验室, 山东 济南 250101
收稿日期: 2016-01-08
作者简介: 高梅(1983-),女,硕士研究生,主管药师,研究方向为药物安全性评价。E-mail:gaomei729@163.com。
摘要: 目的 评价毛蚶提取物的遗传毒性,为评价其安全性提供毒理学依据。 方法 选用体外细菌回复突变(Ames)试验、中国仓鼠肺细胞(CHL)体外染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验,进行毛蚶提取物的遗传毒性研究。Ames试验设5000.0、2500.0、1250.0、625.0、312.5 μg/皿5个剂量;体外CHL细胞染色体畸变试验,设立5.00、2.50、1.25 mg/mL 3个剂量,毛蚶提取物与CHL细胞分别接触6、24 h;小鼠骨髓微核试验,设立5000、2500、1250 mg/kg 3个剂量,给药1次。 结果 Ames试验,毛蚶提取物在加与不加S9时各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,亦无剂量相关性,结果为阴性;CHL染色体畸变试验,毛蚶提取物代谢活化组和非代谢活化组的染色体畸变率均低于5%,染色体畸变试验结果为阴性。小鼠骨髓微核试验,各剂量组的微核率与阴性对照组比较,差异不显著,结果为阴性。 结论 在本试验条件下,毛蚶提取物未见潜在的遗传毒性。
关键词: 毛蚶提取物     遗传毒性     体外细菌回复突变试验     中国仓鼠肺细胞体外染色体畸变试验     微核试验    
Genotoxicity of extract from Arca subcrenata
GAO Mei, CAO Chong, TANG Lian-sheng, MA Hui, ZHANG Sen, ZHU Chun-hua     
Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Chemical Drug, Jinan 250101, China
Abstract: Objective To assess the genotoxicity of extract from Arca subcrenata, in order to provide toxicological basis for evaluating its safety. Methods Ames test, CHL chromosome aberration assay, and bone marrow micronucleus assay in mice were used. In Ames test, there were five dose groups respectively at follows:5000.0, 2500.0, 1250.0, 625.0, and 312.5 mg/plate. In CHL chromosome aberration assay, the doses were 5.00, 2.50, and 1.25 mg/mL, exposure time were 6 and 24 h. In vivo micronucleus assay, there were 3 dose groups:5000, 2500, 1250 mg/kg, for just once. Results In Ames test, in the presence of S9 mixture or not, the number of revertant colonies in five dose groups did not exceed 2-fold of the spontaneous revertant colony number, nor was there a dose-response relationship, the result of Ames test was negative. At the concentration of 1.25-5.00 mg/mL, the extract from A. subcrenata achieved a chromosome aberration of less than 5% with or without S9 mixture, negative response was found. In bone marrow micronucleus assay, compared with negative control group, micronucleus rate of each dose group showed no significant difference, and the result was negative. Conclusion Under this conditions, no genotoxicity was observed in the extract from A. subcrenata.
Key words: extract from Arca subcrenata     genotoxicity     Ames test     CHL chromosome aberration assay     micronucleus assay    

毛蚶Arca subcrenata Lischke是沿海地区常见的经济贝类，肉味鲜美，具补血、健脾等功效，同时还具有一定的药用价值。研究表明，毛蚶提取物中含有丰富的蛋白质、糖类、氨基酸及微量元素铁等物质[1]，具有广泛的药理活性，提取物中的蛋白类具有抗炎、抗肿瘤活性和清除自由基等作用，多糖类具有免疫调节作用等[2, 3, 4, 5, 6]，但对其遗传毒理研究报道较少。为了解毛蚶提取物的致突变性，根据药物遗传毒性研究技术指导原则规定[7]，本研究选用体外细菌回复突变（Ames）试验、中国仓鼠肺细胞（Chinese hamster lung cells，CHL）体外染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验进行毛蚶提取物的遗传毒性研究，为安全用药提供试验依据。

1 材料 1.1 菌株

组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，购自美国MOLTOX公司，经生物学鉴定符合试验要求。

1.2 细胞

CHL细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院，检测无支原体污染。

1.3 动物

昆明小鼠，SPF级，体质量20～24 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK（京）2012-0001。试验在本单位药物安全性评价中心屏障环境动物实验设施进行，实验动物使用许可证号SYXK（鲁）2012-0004。

1.4 主要试剂

毛蚶提取物，由山东省医药工业研究所提供，批号121108，每克提取物相当于7克生药，给药剂量均以提取物量计算；敌克松，美国Supelco公司，批号408-98A；叠氮钠，美国Amresco公司，批号416A052；2-氨基芴、1，8-二羟基蒽醌，美国Sigma公司，批号分别为S90850V、STBC1841V；RPMI 1640，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号NYB0806；胎牛血清，杭州四季青公司，批号130105；注射用丝裂霉素，浙江海正药业股份有限公司，批号120801；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号12032725；肝微粒体酶（S9），美国MOLTOX公司。

1.5 主要仪器

YXQ-LS-50A全自动立式压力蒸汽灭菌器、SPX-250B-Z生化培养箱、BC-J160S CO2细胞培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AUW120D电子分析天平，中国岛津企业管理有限公司；ZHWY-100B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；BDS200倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；E100生物显微镜，日本尼康公司。

2 方法[8, 9, 10, 11] 2.1 Ames试验

选用TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535 5种菌株，试验在加S9和不加S9平行条件下测试，参照指导原则[7]，每一菌株分别设毛蚶提取物5个浓度组，分别为5 000.0、2 500.0、1 250.0、625.0、312.5 μg/皿；阴性对照组加入0.9%氯化钠注射液；阳性对照组，不加S9混合液时，TA97、TA98、TA102加入500 μg/mL的敌克松；TA100、TA1535加入15 μg/mL叠氮钠；加S9混合液时，TA97、TA98、TA100加入2-氨基芴，TA102加入1，8-二羟基蒽醌，浓度均为500 μg/mL；TA1535加入2 mg/mL的注射用环磷酰胺。采用平皿掺入法，每组均设3个平行皿，37 ℃培养48 h后，计数每皿的回变菌落数。试验重复1次。结果表示为每皿的回复突变菌落数。

2.2 染色体畸变试验

取生长良好的CHL细胞，以105/mL浓度接种于25 cm2细胞培养瓶（5 mL/瓶），置37 ℃、5% CO2培养箱中过夜。培养24 h后，吸取培养瓶中的培养液，加入毛蚶提取物，使其终浓度分别为5.00、2.50、1.25 mg/mL，分别培养6、24 h，6 h设立代谢活化组，S9终浓度为1%；阴性对照组加入0.9%氯化钠注射液；阳性对照组在不加S9混合液时为丝裂霉素，浓度为0.15 μg/mL（6 h组）和0.05 μg/mL（24 h组），加S9混合液时为环磷酰胺，浓度为20 μg/mL。分别于培养结束前4 h加入秋水仙素，使染色体停滞在分裂中期，然后收细胞、制片、Giemsa染色，显微镜下观察200个中期分裂相细胞，计数每组细胞的染色体结构畸变。试验重复1次。

细胞畸变率≤5%为阴性（－）；5%≤细胞畸变率≤10%为可疑（±）；10%≤细胞畸变率≤20%为阳性（＋）；20%≤细胞畸变率≤50%为阳性（＋＋）；细胞畸变率＞50%为阳性（＋＋＋）。

2.3 小鼠骨髓微核试验

取健康昆明小鼠60只，按体质量随机分为5组，分别为毛蚶提取物5 000、2 500、1 250 mg/kg剂量组、阴性对照组、阳性对照组，每组12只。阴性对照为0.9%氯化钠注射液，阳性对照为50 mg/kg注射用环磷酰胺溶液。毛蚶提取物、氯化钠注射液ig给予动物，环磷酰胺溶液ip给予动物，给药体积为0.2 mL/10 g，每天给药1次。给药后24～48 h制备胸骨骨髓涂片，所有骨髓涂片经Giemsa染色后读片，每只动物计数2 000个嗜多染红细胞的微核发生率（MPNCE），同时计数200个红细胞，计算PCE/（PCE＋NCE）的比值（PCE：嗜多染红细胞；NCE：正染红细胞）。

2.4 统计学分析

数据均以$ \bar x \pm s $表示，采用DAS 1.0软件进行分析，供试品各剂量组与对照组采用t检验，进行方差统计学分析。

3 结果 3.1 Ames试验

在有和无S9活化系统的条件下，5株菌株的阳性对照组均高于相应的阴性对照菌落数2倍以上，差异显著（P＜0.01），说明试验系统可靠。毛蚶提取物在312.5～5 000.0 μg/皿范围内回变菌落数均未高于相应菌株自发回变菌落数的2倍，与阴性对照组比较，差异不显著（P＞0.05），且无剂量相关性，结果见表 1。表明毛蚶提取物无诱导组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌基因突变作用。

表 1 毛蚶提取物Ames试验结果 ($ \bar x \pm s $, n = 3) Table 1 Results of extract from A. subcrenata in Ames test ($ \bar x \pm s $, n = 3)

3.2 染色体畸变试验

阳性对照中直接诱变剂丝裂霉素在0.15 μg/mL浓度下，CHL细胞染色体畸变率显著增高至35.5%；在0.05 μg/mL浓度下，CHL细胞染色体畸变率显著增高至27%；间接诱变剂环磷酰胺在20 μg/mL浓度下，经S9活化，染色体畸变率升高至28%；结果判断为阳性。而阴性对照组在有S9和无S9两种测试条件下，染色体结构畸变率均小于5%，结果判断为阴性，说明试验系统可靠。毛蚶提取物在1.25～5.00 mg/mL剂量范围内，在活化系统和非活化系统两种测试条件下，6和24 h收获CHL细胞进行染色体畸变分析，各剂量组的染色体畸变率均小于5%，未诱发明显的染色体畸变，且未呈现剂量-效应关系，结果判定为阴性。结果见表 2。

表 2 毛蚶提取物对CHL细胞染色体畸变试验结果 Table 2 Results of chromosomal aberration assay in CHL cells induced by extract from A. subcrenata

表 3 毛蚶提取物对小鼠骨髓微核率形成的影响 ($ \bar x \pm s $, n = 6） Table 3 Results of bone marrow micronucleus assay for extract from A. subcrenata ($ \bar x \pm s $, n = 6)

3.3 小鼠骨髓微核试验

结果显示，阴性对照组与阳性对照组的PCE/（PCE＋NCE）比值差异不显著（P＞0.05），MPNCE差异显著（P＜0.01），说明试验系统可靠。统计学分析，毛蚶提取物各剂量组给药24～48 h后取材，PCE/（PCE＋NCE）比值与阴性对照组比较，差异不显著（P＞0.05），表明对骨髓细胞的造血功能没有产生抑制作用，各剂量组微核率与阴性对照组比较，差异不显著（P＞0.05）。说明毛蚶提取物各剂量组对小鼠骨髓细胞无致微核作用。

4 讨论

药物遗传毒性，是指药物诱发的遗传物质在染色体水平、分子水平和碱基水平上的各种损伤而造成的毒性作用，主要包括药物致染色体畸变、药物致DNA损伤和药物致基因突变3类。对药物进行遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，是药物进入临床试验及上市的重要环节，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点的不同，我国药物遗传毒性研究技术指导原则推荐遗传毒性试验组合由以下几个试验：体外细菌基因突变试验、染色体损伤细胞遗传试验（体外中期染色体畸变试验或微核试验）、体内遗传毒性试验（啮齿类动物造血细胞染色体损伤试验或体内中期细胞微核或染色体畸变试验）。

毛蚶提取物是从鲜毛蚶软体部分提取而来，对它的研究主要集中在其抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等药理活性方面[12, 13, 14, 15]，但对其毒理研究报道甚少，尤其是遗传毒性的问题。因此，本试验对毛蚶提取物进行了体外致突变作用的评价，采用Ames试验、CHL细胞体外染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，从基因水平、染色体水平、动物水平，采用体内、体外试验相结合，研究了毛蚶提取物的遗传毒性。3个试验剂量的设计，都是指导原则所要求的最大剂量，使得药物暴露量得到了保证，同时均设立阴性、阳性对照，保证了试验系统的可靠性。其中，小鼠骨髓微核试验，指导原则规定骨髓采样时间，如果采用单次给药，至少应采样2次，骨髓采样时间应在给药后24～48 h内，如果采用重复给药，可只采样1次，骨髓采样时间应在末次给药后18～24 h。本实验采取第1种方案，即毛蚶提取物染毒1次，药后24～48采样2次，以便取样点能覆盖微核形成高峰期。研究结果表明，在本试验条件下，毛蚶提取物在312.5～5 000 μg/皿剂量范围内，无诱发鼠伤寒沙门氏菌基因突变作用，结果显示为阴性；在1.25～5.0 mg/mL浓度范围内，未见诱发CHL细胞染色体畸变作用；在所测1 250～ 5 000 mg/kg剂量范围内无诱发嗜多染红细胞微核率增高的作用，小鼠骨髓微核试验呈阴性。表明在本实验条件下，毛蚶提取物未见潜在的遗传毒性。但是，对于毛蚶提取物的其它毒性，如长期毒性等，还需进一步的动物体内试验研究。

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