人体产生的自由基及其诱导的氧化反应与多种疾病密切相关，并可加速人体衰老。衰老始终对人类的健康构成重大威胁。研究发现^{[1, 2]}，衰老程度与人体产生的自由基及其诱导的氧化反应密切相关。人体内的各种氧化反应可以导致机体产生氧化损伤，诱发氧化应激，继而导致各类疾病，从而加速人的衰老。

近年来，寻找和开发天然植物抗氧化剂，消除氧自由基对机体的损害作用，已逐渐成为研究热点，我国中草药资源极其丰富，是天然抗氧化剂的重要来源之一。野牡丹Melastoma candidum D. Don在华南地区广泛存在，其活性成分为多糖、黄酮类、氨基酸、脂肪族、甾体、酚类、常量和微量元素、色素等^[3]，临床多利用其清热解毒、利湿消肿等功效，主治肠炎、痢疾等疾病^[4]，其中含量丰富的黄酮类化合物组分具有较高的抗氧化、抗衰老开发应用价值^[5]，但目前暂未有此方面的应用开发。

本文利用醇提结合超声浸提的方法提取野牡丹总黄酮，以维生素C（Vc）和芦丁为对照，采用自由基清除能力法（DPPH）和抗氧化剂还原能力法（FRAP）来评估野牡丹活性提取物的体外抗氧化活性，为野牡丹的开发利用提供依据。

VGT—103A型超声波清洗器（深圳市威固特超声波科技开发有限公司）；UV757CRT型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；PHS—3C酸度计（上海佑科仪器公司）；微量移液器（Eppendorf公司）。

二苯代苦味酰基自由基（1, 1-pheny-2- picrylhydrazyl，DPPH，Tokyo Chemical Industry，批号U6GVH-HK）；FRAP工作液（300 mmol/L醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ，20 mmol/L FeCl₃，临用时现配）；TPTZ（2, 4, 6-tripyridyl-s-trizine，萨恩化学技术有限公司，批号BI130025）；Vc（中国医药集团上海化学试剂公司，批号20120628）；芦丁（成都曼思特生物科技有限公司，批号11040302）；野牡丹提取液（自制）。

野牡丹提取液总黄酮的测定采用铝盐显色 法^[6]。精密称取芦丁对照品12.5 mg，置于100 mL量瓶中，用体积分数为50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.125 mg/mL的芦丁标准贮备液，分别准确吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，加入0.3 mL质量分数为5%NaNO₂溶液，摇匀，静置5 min后，加质量分数为10%AlCl₃甲醇溶液0.3 mL，摇匀静置5 min，再加1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，用50%甲醇定容至刻度，此时芦丁的质量浓度依次为12.5、25.0、37.5、50.0、62.5 μg/mL，摇匀静置10 min，采用试剂为空白参比，在200～800 nm波长扫描，选择最佳吸收峰波长，并在此波长下绘制工作曲线。

称取50 g经烘干粉碎后过50目筛的野牡丹药材粗粉，按液固体积比5∶1加入95%乙醇，水浴加热回流1 h后，滤过，收集滤液，重复操作一次；取滤渣按液固体积比10∶1加入体积分数50%乙醇浸提过夜后超声波提取1 h，滤过，收集滤液；合并滤液，减压真空浓缩到200 mL，得野牡丹提取液。吸取0.1 mL野牡丹提取液，置于10 mL量瓶中，按上述显色方法测定吸光度值，代入芦丁标准曲线，计算提取液总黄酮的量，结果以芦丁当量/干材料表示，单位为mg/g。

DPPH自由基是一种稳定存在的有机自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在特定波长处有强吸收，当加入抗氧化剂后吸收峰值下降，下降程度直接反映样品清除自由基能力的大小^[7]。各物质对DPPH•的清除能力大小是其抗氧化能力强弱的评价指标之一，可用清除率表示，清除率高则抗氧化能力强。

分别将Vc、芦丁、野牡丹提取液和DPPH自由基无水乙醇溶液混合，待反应稳定后，采用试剂空白作为参比，在200～800 nm波长扫描，选择最佳测定吸收波长。

精密称取5.0 mg DPPH，采用无水乙醇定容至100 mL，配成质量浓度为50 mg/L的DPPH无水乙醇溶液作为标准贮备液，本溶液需要临用时现配。

精密移取50 mg/L的DPPH无水乙醇溶液4.0 mL，加入质量浓度分别为5、10、20、40、60、80、100、200 μg/mL野牡丹提取液（以总黄酮计）1.0 mL，使得反应体系的终体积为5 mL，充分混匀，记录加入野牡丹提取液后1、3、5、10、15、20、25、30 min时在波长517 nm处测定吸光度值，同时平行测定空白对照管和试剂空白管的吸光度值，按下式计算对野牡丹提取液对DPPH自由基的清除率。

清除率＝1－（A_i－A_j）/A₀

A₀为4.0 mL 50 mg/L DPPH•乙醇溶液＋1.0 mL空白试剂的吸光度值；A_i为4.0 mL 50 mg/L DPPH•乙醇溶液＋1.0 mL样液的吸光度值；A_j为4.0 mL无水乙醇溶液＋1.0 mL样液的吸光度值。

分别配制质量浓度为5、10、20、40、60、80、100、200 μg/mL芦丁溶液和V_C溶液作为对照检测液，按上述方法分别测定8个浓度下的两种对照检测液在不同时间对DPPH自由基的清除率。

为了更好的比较三者的抗氧化能力，以半数清除浓度（IC₅₀）来表征其清除能力大小，将8个不同浓度的样品溶液测得的DPPH 自由基的清除率采用非线性回归分析得出各自的IC₅₀值，IC₅₀值越小，表示其清除自由基的能力越强^[8]。

采用铁还原/抗氧化能力（Ferric reducing/ antioxidant power，FRAP）分析法评估所选野牡丹提取液的总抗氧化活性^[9]。该分析方法的原理是抗氧化物质将Fe³⁺还原为Fe²⁺，Fe²⁺与三吡啶三吖嗪（TPTZ）结合生成蓝色络合物，该化合物在593 nm处有最大吸收，吸光度值的大小反应了该抗氧化剂的还原能力大小。

分别配制300 mmol/L的醋酸盐缓冲溶液（pH 3.6）、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的FeCl₃溶液，将上述3种溶液按体积比10∶1∶1混合，并水浴加热至37 ℃， 备用。

精密称取0.027 81 g FeSO₄•7H₂O粉末，用超纯水溶解，转移至100 mL量瓶中，配成浓度为1 mmol/L的贮备液。分别精密移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至10 mL量瓶中，配制成浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的铁标准溶液，备用。

精密移取上述系列溶度铁标准溶液各0.1 mL，加入FRAP工作液3 mL，混匀37 ℃反应完全，使用超纯水作空白，于400～800 nm扫描得到最大吸收波长，于此波长处测定各吸光度值，绘制FeSO₄的标准曲线。

分别配制质量浓度为5、10、20、40、60、80、100、200 μg/mL的野牡丹提取液、芦丁溶液和Vc溶液作为FRAP检测液。分别量取检测液0.1 mL，加入3 mL FRAP工作液，混匀后使用超纯水作空白，在最大吸收波长处测定其在37 ℃下反应不同时间的吸光度值，代入FeSO₄标准曲线求算成当量FeSO₄值，以对不同浓度的不同样品对Fe³⁺的还原能力随时间的变化关系进行比较研究，样品的当量FeSO₄值越大表示其还原能力越强。

野牡丹提取液总黄酮的测定采用硝酸铝显色法，以试剂参比为空白，在200～800 nm扫描发现在510 nm处有最大吸收，在该波长下测定吸光度无杂质干扰。测定芦丁对照品系列溶液的吸光度值，得回归方程为A＝13.04C＋0.012 2，R²＝ 0.999 2。测定野牡丹提取液的吸光度，根据标准曲线及稀释倍数测得野牡丹药材总黄酮提取率为9.72 mg/g。

Vc、芦丁、野牡丹提取液和DPPH自由基无水乙醇溶液混合后经紫外扫描发现，DPPH自由基溶液的最大吸收波长在327 nm和517 nm附近。而野牡丹提取液、芦丁以及Vc溶液在517 nm处基本没有吸收，不会干扰DPPH自由基溶液在517 nm处吸收度的检测。因此本实验选择517 nm处的吸光度值来表征DPPH自由基的变化。

不同浓度的野牡丹提取液（以总黄酮计）对于DPPH自由基的清除率随时间变化见图 1。可以看出，低质量浓度时（总黄酮量为5～60 μg/mL）的野牡丹提取液，DPPH自由基清除率在20 min左右基本达到稳定，随着野牡丹提取液质量浓度的增加，DPPH自由基的清除率也逐渐提高，加入高质量浓度的野牡丹提取液时（总黄酮量为60 μg/mL以上），DPPH•清除率在5 min左右达到稳定，极高质量浓度时1 min左右就能达到稳定，达到稳定状态时DPPH自由基的清除率最高为83.80%。

图 1 野牡丹提取液对DPPH自由基的清除作用Fig. 1 Effectof extract from M. candidum on DPPH scavenging activity

芦丁溶液加入到DPPH自由基溶液中，其对于DPPH自由基的清除率随时间变化见图 2，低质量浓度（5～60 μg/mL）时，同样需要约20 min左右DPPH清除率才不会出现大幅度变化，高质量浓度（80～200 μg/mL）时，DPPH自由基清除率在5 min左右也能达到稳定，达到稳定状态时DPPH自由基的清除率最高为81.67%。

图 2 芦丁对DPPH自由基的清除作用Fig. 2 Effect of rutin on DPPH·scavenging activity

Vc属于一种快速抗氧化剂，清除自由基的速度很快，向DPPH自由基溶液中加入Vc后DPPH自由基的清除率随时间变化见图 3，可以看出，Vc加入到DPPH自由基溶液中后，DPPH自由基清除率迅速上升，并且很快就可以达到稳定，即使是质量浓度低至5 μg/mL时，也能够在1 min左右即达到稳定，随着时间的延长DPPH自由基清除率变化很小。且Vc加入量从5 μg/mL增大到60 μg/mL时，DPPH自由基清除率升高的幅度很大，继续提高Vc的浓度，DPPH自由基清除率升高的幅度无明显 变化。

图 3 Vc对DPPH自由基的清除作用Fig. 3 Effect of Vc on DPPH·scavenging activity

达到稳态（20 min）时Vc、芦丁、野牡丹提取液等3种抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用见图 4，从图中可以看出，3种抗氧化剂对DPPH自由基的清除作用都随着质量浓度升高而逐渐增强，在质量浓度为100 μg/mL时，野牡丹提取液等3种抗氧化剂对DPPH自由基清除率均在80%以上，具有较强的自由基清除能力，IC₅₀值见表 1。

图 4 3种抗氧化剂对DPPH自由基的清除曲线Fig. 4 Curvesof scavenging effects of three antioxidants on DPPH·

表 1(Table 1)

表 1 3种抗氧化剂对DPPH自由基清除能力比较 Table 1 Comparison of three antioxidants with DPPH·scavenging capacity 样品 清除率/% IC50/(μg∙mL−1) Vc 92.96 14.06 芦丁 80.36 21.42 野牡丹提取液 82.65 23.71

表 1 3种抗氧化剂对DPPH自由基清除能力比较 Table 1 Comparison of three antioxidants with DPPH·scavenging capacity

表 1中所示的IC₅₀值越小，样品清除自由基的能力越强。各样品清除DPPH自由基的能力为：Vc＞芦丁＞野牡丹提取液；质量浓度为100 μg/mL的样品溶液，最终自由基清除率大小为Vc＞野牡丹提取液＞芦丁，说明野牡丹提取液的抗氧化能力和芦丁相当。

将低质量浓度的野牡丹提取液、芦丁溶液（质量浓度为10～60 μg/mL）分别与DPPH自由基的清除率在达到稳态后（20 min的数据）进行线性回归，回归方程分别为SR＝876.49C＋24.28，R²＝0.991 4（野牡丹提取液），和SR＝886.71C＋27.47，R²＝0.973 3（芦丁），说明两种样品对DPPH自由基的清除率分别与总黄酮和芦丁的质量浓度具有一定的相关性。

铁标准溶液加入FRAP工作液显色后，最大吸收波长为593 nm，于此波长测定系列铁标准溶液的吸光度值，得FeSO₄标准溶液的标准曲线为A＝0.583 7C＋0.121 6，R²＝0.999 6，结果线性良好，方法可靠。

不同浓度的野牡丹提取液（浓度以总黄酮计）、芦丁溶液和Vc溶液对Fe³⁺的还原能力随时间的变化见图 5～7。比较研究发现，当野牡丹提取液和芦丁加入到FRAP工作液中后，FeSO₄当量随样品浓度的增加而增加，不同质量浓度的样品待测液在30 min后仍有升高的趋势，并未达到稳定平衡状态，单位时间内低浓度的野牡丹提取液对应的FeSO₄当量升高幅度与芦丁相近，高浓度的野牡丹提取液对应的FeSO₄当量升高幅度明显高于芦丁，说明野牡丹提取液的抗氧化能力可能优于芦丁。而Vc为快速抗氧化剂，向FRAP工作液中加入不同浓度的Vc溶液后，FeSO₄当量都迅速增大，1 min即迅速达到稳定，随着时间的延长FeSO₄当量变化不大，而增加Vc的加入量，当量FeSO₄明显升高。

图 5 不同浓度的野牡丹提取液还原Fe3+能力曲线图Fig. 5 Curvesof Fe3+ reducing power of extract from M. candidum at different concentration

图 6 不同浓度的芦丁溶液还原Fe3+能力曲线图Fig. 6 Curvesof Fe3+ reducing power of rutin at different concentration

图 7 不同浓度的Vc溶液还原Fe3+能力曲线图Fig. 7 Curvesof Fe3+ reducing power of Vc at different concentration

野牡丹提取液、芦丁溶液对铁离子的还原能力与质量浓度（10～100 μg/mL）也呈良好的量效关系，回归得到的线性方程分别为：Y＝6.036 1X＋0.167 9，R²＝0.992 6（野牡丹提取液液），Y＝5.361 5X＋0.120 8，R²＝0.993 9（芦丁）。

以对应0.5 mol/L FeSO₄当量对应的各样品质量浓度来比较各个样品的相对抗氧化能力，结果分别为：野牡丹提取液中总黄酮的质量浓度55 μg/mL；芦丁质量浓度70 μg/mL；Vc的质量浓度37 μg/mL；各个样品的相对抗氧化能力为：Vc＞野牡丹提取液＞芦丁。

本实验采用DPPH自由基清除率和FRAP模型，以Vc和芦丁作为比较对照，测定了野牡丹提取液的抗氧化活性。发现野牡丹提取液对DPPH自由基有较好的清除率，对Fe³⁺具有较好的还原能力，其抗氧化活性在一定浓度范围内与黄酮的含量具有较好的相关性。野牡丹药材强的抗氧化能力可能与其含有较高的黄酮类成分有关，野牡丹药材具有的强抗氧化能力，有进一步研究和开发的价值。