现代药物与临床  2017, Vol. 32 Issue (2): 183-187
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2017.02.005
向丽, 张贵君, 王佳琳, 郭亚芳, 杨颜芳, 彭慧, 孙启玉, 刘亮. 桂枝甘草汤中10种成分在不同煎煮时间的变化研究[J]. 现代药物与临床, 2017, 32(2): 183-187.
XIANG Li, ZHANG Gui-jun, WANG Jia-lin, GUO Ya-fang, YANG Yan-fang, PENG Hui, SUN Qi-yu, LIU Liang. Changes of 10 components in Guizhi Gancao Decoction at various decocting time[J]. DRUGS&CLINIC, 2017, 32(2): 183-187.
桂枝甘草汤中10种成分在不同煎煮时间的变化研究
向丽1, 张贵君1,2, 王佳琳1, 郭亚芳1, 杨颜芳1, 彭慧2, 孙启玉2, 刘亮2     
1. 北京中医药大学 中药学院, 北京 100102;
2. 淄博万杰中医药研究所, 山东 淄博 255213
收稿日期: 2016-10-28
基金资助: 北京中医药大学在读研究生项目（2016-JYB-XS103）
作者简介: 向丽(1990-),女,硕士,研究方向:中药药效组分及药效组分质量评价体系研究。Tel:15624965368,E-mail:370012429@qq.com
通信作者: 张贵君(1954-),男,博士,教授,博士研究生导师,研究方向:中药鉴定方法学、中药药效组分、中药质量标准化研究。Tel:13501027481,E-mail:guijunzhang@163.com
摘要： 目的 考察桂枝甘草汤中甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛10种成分在不同煎煮时间下的变化。 方法 采用HPLC-DAD多波长切换法同时测定不同煎煮时间（10、20、30、40、50、60、90 min）下桂枝甘草汤中10种成分。Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱；体积流量：0.8 mL/min；柱温：20℃；进样量：20 μL；检测波长：230 nm（甘草苷、甘草素、苯甲酸钠）、254 nm（甘草酸，桂皮醇）、276 nm（香豆素、桂皮酸、桂皮醛）、370 nm（异甘草苷、异甘草素）。 结果 随着煎煮时间的延长，10种成分的总量在30 min处达到最大值，且最终趋向稳定；桂枝中各成分的变化大体上是先增加后减少，在30 min处达到最大值；炙甘草中各成分量的变化除了在40 min处有减少外，基本呈现递增趋势。 结论 确定桂枝甘草汤的煎煮时间为30 min，为其临床应用提供了科学依据。
关键词： 桂枝甘草汤     甘草酸     甘草苷     桂皮醛     煎煮时间     HPLC-DAD多波长切换法    
Changes of 10 components in Guizhi Gancao Decoction at various decocting time
XIANG Li1, ZHANG Gui-jun1,2, WANG Jia-lin1, GUO Ya-fang1, YANG Yan-fang1, PENG Hui2, SUN Qi-yu2, LIU Liang2     
1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China;
2. Zibo Wanjie Institute of Traditional Chinese Medicine, Zibo 255213, China
Abstract: Objective To investigate the changes of 10 components, such as glycyrrhizic acid, liquiritin, isoliquiritin, isoliquiritigenin, liquiritigenin, sodium benzoate, coumarin, cinnamic alcohol, cinnamic acid, and cinnamaldehyde in Guizhi Gancao Decoction at various decocting time. Methods The contents of 10 active components in Guizhi Gancao Decoction decocted with different decocting time (10, 20, 30, 40, 50, 60, and 90 min) were simultaneously determined by HPLC-DAD with changing ultraviolet-visible wavelength. Diamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was carried out. The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (H3PO4) with gradient elution, with a flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 20℃, and injection volume was 20 μL. The detection wavelength was set at 230 nm (liquiritin, linquiritigenin, and sodium benzoata), 254 nm (glycyrrhizic acid and cinnamic alcohol), 276 nm (coumarin, cinnamic acid, and cinnamaldehyde), and 370 nm (isoliquiritin and isolinquiritigenin). Results With the extension of decocting time, the content of 10 components had maximum at 30 min and tended to be stable. The content of each component in Cinnamomi Ramulus firstly increased to the highest levels at 30 min and then decreased. And content of each component in Glycyrrhizae Radix basically showed an upward trend except at 40 minutes. Conclusion The optimized decocting time of Guizhi Gancao Decoction is confirmed for 30 min, which provids a scientific basis to its clinical application.
Key words: Guizhi Gancao Decoction     glycyrrhizic acid     liquiritin     cinnamaldehyde     decocting time     HPLC-DAD with changing    

桂枝甘草汤出自东汉时期张仲景《伤寒论》，由桂枝（去皮）和炙甘草按质量比2:1组成，具有温补心阳、生阳化气之功效，是治疗心阳虚之祖方[1]。其有效成分主要有挥发油类、有机酸类、香豆素类、甾体类、黄酮类、三萜类、生物碱类以及多糖类成分[2-3]。桂枝甘草汤以汤剂入药，而影响汤剂的质量因素众多，如浸泡、加水量、煎煮时间、煎煮火候、煎煮次数、煎药器具等[4]。目前常见的中药煎煮方法为浸泡20～30 min，加水量以浸泡后淹没药材2～3 cm为准，火候“先武后文”，煎煮2次，煎煮的器具多为砂锅[5-6]，而煎煮时间的长短则往往由药物的气味质地决定。中药多以复方入药，不同性质的药味其煎煮时间不一致。而目前对煎煮时间考察多停留于单味药，考察指标也往往局限于少数几个成分或某一类成分，忽略了中药复方的复杂性和整体性。因此对由不同气味质地的单味药配伍组成的复方进行煎煮时间考察是及其必要的。因此，本研究以桂枝甘草汤中甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛作为指标，采用HPLC-DAD法测定不同煎煮时间下的各成分的变化，确定其最佳煎煮时间，为桂枝甘草汤的质量控制提供理论依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

UltiMate 3000 Series型高效液相色谱仪（Thermo）；AL104型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂

炙甘草购自河北省安国市万联中药饮片有限公司，桂枝购自聚旭堂药店，以上药材经北京中医药大学中药学院中药鉴定系张贵君教授鉴定分别为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎、樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝；甘草酸（批号150407）、甘草苷（批号141029）、异甘草苷（批号150714）、甘草素（批号150511）、异甘草素（批号141020）、香豆素（批号150419）、桂皮醇（批号160503）、桂皮酸（批号140924）、桂皮醛（批号160503）对照品购于成都普菲德生物技术有限公司，质量分数均≥98%；苯甲酸钠对照品（批号100433-200301，质量分数≥98%）由中国食品药品检定研究院提供；乙腈（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯净水（杭州哇哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为55.5、47.5、42.5、40.5、38.5、11.0、29.1、30.0、55.0、30.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取12 g桂枝、6 g炙甘草，共7份，分别加入10倍量水，浸泡30 min，先用武火加热至沸后，再分别用文火保持微沸10、20、30、40、50、60、90 min，共煎2次，合并滤液，冷却，加水至360 mL，混匀。分别精密量取3 mL滤液置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心5 min，上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。按上述方法每个时间组重复3次，并制备缺桂枝和缺炙甘草的阴性样品溶液。

2.3 色谱条件

Hypersil Gold-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱：0～5 min，5%～21% A；5～10 min，21%～25% A；10～15 min，25%～28% A；15～18 min，28%～31% A；18～35 min，31%～32% A；35～37 min，32%～42% A；37～50 min，42%～47% A；50～55 min，47%～5% A；55～65 min，5%；体积流量：0.8 mL/min；柱温：20 ℃；进样量：20 μL；检测波长：230 nm（甘草苷、甘草素、苯甲酸钠）、254 nm（甘草酸，桂皮醇）、276 nm（香豆素、桂皮酸、桂皮醛）、370 nm（异甘草苷、异甘草素）。色谱图见图 1。

图 1 混合对照品（A）、缺炙甘草阴性样品（B）、缺桂枝阴性样品（C）和桂枝甘草汤（D）的HPLC图谱 Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A),negative sample without Glycyrrhizae Radix (B),negative sample without Cinnamomi Ramulus (C) and Guizhi Gancao Decoction (D) 1-甘草苷 2-异甘草苷 3-苯甲酸钠 4-香豆素 5-甘草素 6-桂皮醇 7-桂皮酸 8-甘草酸 9-桂皮醛 10-异甘草素 1-liquiritin 2-isoliquiritin 3-sodium benzoate 4-coumarin 5-liquiritigenin 6-cinnamic alcohol 7-cinnamic acid 8-glycyrrhizic acid 9-cinnamaldehyde 10-isoliquiritigenin

2.4 线性关系考察

分别精密称取甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为214.0、84.0、16.6、5.7、3.9、7.8、19.4、12.0、44.0、100.0 μg/mL的混合对照品溶液（母液）。各精密量取母液4.0、3.0、2.0、1.0、0.5、0.1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，分别进样20 μL测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归处理，各成分线性回归方程、线性范围及相关系数见表 1。

表 1 10种成分的线性回归方程、线性范围及相关系数 Table 1 Calibration curves,linear ranges,and correlation coefficients of 10 components

2.5 精密度试验

精密吸取对照品混合溶液10 μL，连续进样6次，测定并计算甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛峰面积的RSD值，结果分别为0.30%、0.16%、0.15%、0.24%、0.57%、0.34%、0.18%、0.26%、0.17%、0.16%。

2.6 重复性试验

精密称取12 g桂枝、6 g炙甘草，按2.2项下方法制备6份煎煮时间为30 min的供试品溶液，分别进样20 μL，测定并计算甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛质量分数的RSD值，结果分别为1.11%、1.02%、1.10%、1.43%、1.26%、1.05%、1.35%、0.77%、1.19%、0.75%。

2.7 稳定性试验

精密吸取煎煮时间为30 min的供试品溶液20 μL，分别于制备后的0、2、4、8、12、24 h进样测定，测定并计算甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛峰面积的RSD值，结果分别为0.37%、0.88%、0.90%、1.48%、0.99%、1.37%、1.39%、0.45%、0.41%、0.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知各成分质量浓度的煎煮时间为30 min的供试品溶液1.5 mL，平行9份，于10 mL量瓶中，分别加入供试品溶液的80%、100%、120%质量的对照品各3份，制备供试品溶液，测定并计算甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、苯甲酸钠、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛的回收率。结果各成分的平均回收率分别为99.17%、98.03%、98.94%、98.58%、97.77%、97.90%、98.26%、99.11%、98.78%，RSD值分别为0.61%、0.43%、0.52%、1.02%、1.26%、1.38%、1.19%、0.97%、0.74%、0.68%。

2.9 各成分测定和变化

将制得的不同煎煮时间的桂枝甘草汤样品进样测定，根据标准曲线计算各样品中10种成分的质量浓度，其变化趋势见图 2。

图 2 桂枝甘草汤中中各成分含量及总量变化趋势 Fig. 2 Change trend of each or total content of components in Guizhi Gancao Decoction

可以看出，随着煎煮时间延长，各成分的量均发生改变，在10～30 min均呈现递增趋势，30 min之后的变化趋势则不尽相同，如桂枝部分桂皮醛、香豆素呈持续递减趋势；桂皮酸、桂皮醇和苯甲酸钠则先减少后增加。炙甘草部分甘草酸、甘草苷、异甘草苷先减少后增加；甘草素和异甘草素则继续增加，在50 min处达到最大值随后减少趋向平缓。还可以发现，桂枝中各成分总量同桂皮醛变化趋势相似：先增加后减少，在30 min时达到最大值；炙甘草各成分总量同甘草酸、甘草苷变化趋势相似：先增加，至30 min后减少，再增加；10种成分总量和炙甘草5种成分总量变化趋势相似。

3 讨论

复方中药由两种或两种以上的单味药按照君臣佐使的原则配伍形成，而每味药的药物性质存在一定的差异，有的药物随着煎煮时间的延长，其有效成分溶出的越多[7]，有的药物因含有易挥发性成分则不宜久煎，如桂枝甘草汤中桂枝属于芳香类药物，其有效成分多为挥发类，不宜久煎，实验结果亦表明桂枝各成分总量在30 min处达到最大值，之后则有所下降。而炙甘草中各成分总量除在40 min处有所下降外基本上呈现上升的趋势，说明煎煮时间的延长有利于炙甘草中有效物质的溶出。随着煎煮时间的增加，10种成分的量变化各不相同，其最佳煎煮时间也不同。当把它们进行相加时，发现在30 min处有最大值，这一结果与传统煎煮时间相吻合，亦说明通过某个或少数几个成分的量来考察煎煮时间不够全面，应选择能体现中药整体性的有效成分作为其考察指标。总而言之，对于药物性质较复杂的复方，正确掌握其煎煮时间对提高用药质量和临床疗效具有重大意义。

参考文献
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