据世界卫生组织估计，到2020年急性冠状动脉梗阻性疾病将是人类的主要致死原因，不管通过内科用药还是介入和搭桥手术，冠状动脉再通后直接面临心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤是心肌组织在较长时间缺血后恢复血液灌流，反而出现比再灌注前更明显、更严重的损伤和功能障碍，包括收缩功能降低、冠脉流量下降及血管反应性改变。因此，如何有效地保护缺血心肌、减轻心肌缺血再灌注损伤是目前医学研究领域令人关注的重要问题。四氢生物蝶呤是一氧化氮合酶（eNOS）生成一氧化氮（NO）必须的辅助因子。研究发现^[1]，外源性补充四氢生物蝶呤可以提高一氧化氮合酶的活性，促进内源性NO的生成，改善内皮功能不全导致的心血管疾病，减轻氧化应激，改善心肌缺血再灌注损伤。脑钠素（BNP）作为心衰的定量标志物，反映左室的收缩和舒张功能^[2]，对于心功能不全具有极大的诊断价值。β3受体对心血管疾病的病理生理具有重要的作用，其功能在心血管系统越来越受到重视，即将成为心脏疾病治疗的潜在靶点。本研究采用大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型，观察四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤心肌舒张功能和心肌梗死程度的影响，及其与β3受体之间可能的关系。

健康成年Wistar大鼠50只，SPF级，体质量180～220 g，雌雄各半，平均周龄60 d，购自甘肃省中医学院动物实验室，动物使用合格证号SYXK（甘）2015-0005，室温饲养，基础饲料为甘肃省中医院基础实验室提供的普通动物饲料，自由摄食和饮用自来水，饲养环境为清洁级。

戊巴比妥钠、肝素钠、四氢生物蝶呤（批号BJZ1536，质量分数99%以上）均购自广州库威生物科技有限公司，大鼠BNP酶联免疫分析试剂盒、大鼠心肌NO测定应用硝酸盐酶联免疫分析试剂盒、内皮型eNOS测试盒均购自南京建成生物工程研究所，肾上腺素能受体β3抗体（镇江厚普生物科技公司，货号PR-1635）。

自动生化分析仪，Biolap-410生物信号分析系统，HX－100E型小动物呼吸机，病理图像采集与分析系统，低温冷冻离心，Millar大鼠心导管。

大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组及四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组，每组10只。对照组、假手术组和模型组均ig生理盐水2 mL；四氢生物蝶呤与等体积生理盐水混匀，四氢生物蝶呤组ig四氢生物蝶呤5、10 mg/kg。1次/d，连续给药14 d。

模型组按照文献^[3]方法稍加改进，ip戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉大鼠，固定于手术台上。行气管切开，动物呼吸机进行辅助呼吸，胸骨左旁第3～4肋间切开皮肤，开胸，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，心电图显示ST段抬高，提示结扎成功。结扎30 min后打开结扎线，再灌注4.5 h。假手术组仅在左冠状动脉前降支位置取同样大小的针缝针而不打结，余方法均同模型组。

暴露右侧颈总动脉，导管法测定血流动力学（Millar大鼠心导管，Biolap-410生物信号分析系统），动态记录左室血流动力学指标：左心室舒张最大速率（-dp/dt_max）、左心室舒张期末压（LVEDP）、左室开始收缩至左室内压上升速率峰值时间（Tau）。

各组大鼠再灌注4.5 h后，取大鼠颈动脉血2 mL，离心后应用ELISA法测定血浆BNP活性。按试剂盒说明测定L-精氨酸转化为L-瓜氨酸代表心肌eNOS活性，NO₃^-＋NO₂^-表示NO生成量。

再灌注4.5 h后用颈椎脱臼法处死大鼠，取出心脏。心肌梗死范围测定根据文献报道方法^[4]，以伊文思蓝和氯化三苯四氮唑磷酸缓冲液（TTC，pH 7.4）染色心脏标本，以区分危险区和坏死区，伊文思蓝染色正常心肌呈蓝色，TTC染色正常心肌和危险心肌呈砖红色，梗死心肌染色呈白色。数码照相，通过计算机图像分析软件image-Pro计算左室总面积和梗死心肌面积，以梗死心肌面积占整个左室心肌面积的百分比表示梗死程度。

使用10% KCl用压力灌注法获得舒张期心脏，冰冻切片厚度为6 mm，固定于10%福尔马林中，分别用抗β3-AR抗体4 ℃孵育过夜，用二抗37 ℃孵育1 h，切片用DAB染色。对β3免疫组化图片应用Image-Pro软件，以density-mean为统计量进行处理。

实验数据以x±s表示，用SPSS 17.0软件进行统计学处理。非正态分布资料取对数进行转换，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。

与对照组、假手术组比较，模型组-dp/dt_max、LVEDP显著增高，Tau明显延长；与模型组比较，四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组-dp/dt_max显著增高，LVEDP显著降低，Tau明显缩短，差异均具有统计学意义（P＜0.05、0.01），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血流动力学的影响（x±s ） Table 1 Effects of tetrahydrobiopterin on hemodynamics of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s) 组别 n/例 剂量/(mg·kg-1) -dp/dtmax/(mmHg·s-1) LVEDP/mmHg Tau/ms 对照 10 — -6513.0±129.0 6.1±0.5 12.8±0.3 假手术 10 — -6897.1±197.2 5.9±0.4 13.5±0.3 模型 9 — -3928.6±79.8** 22.2±0.7** 24.5±0.6** 四氢生物蝶呤 9 5 -4915.1±33.4▲▲ 10.5±0.8▲▲ 19.1±1.0▲▲ 10 10 5085.1±134.9▲▲ 8.9±0.4▲▲ 17.7±1.1▲▲ 与假手术、对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲▲P＜0.01 （1 mmHg＝133 Pa） **P < 0.01 vs control group and Sham group; ▲▲P < 0.01 vs the model group (1 mmHg＝133 Pa)

表 1 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血流动力学的影响（x±s ） Table 1 Effects of tetrahydrobiopterin on hemodynamics of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s)

与假手术组、对照组比较，模型组血浆BNP、eNOS活性明显增高，NO生成量显著下降（P＜0.01、0.05）；与模型组比较，四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组血浆BNP显著下降，eNOS活性、NO生成量均显著升高（P＜0.01），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血浆BNP、eNOS活性、NO生成量的影响（x±s ） Table 2 Effects of tetrahydrobiopterin on activities of BNP and eNOS,and NO generating capacity rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s ) 组别 n/例 剂量/(mg·kg-1) BNP/(pg·mL-1) eNOS活性/% NO生成量/(μmol·mg-1) 对照 10 — 6.4±0.5 0.63±0.01 3.58±0.32 假手术 10 — 6.4±0.2 0.62±0.01 3.66±0.22 模型 9 — 7.9±0.7** 0.65±0.01 2.94±0.18** 四氢生物蝶呤 9 5 6.9±0.4▲▲ 0.75±0.02▲▲ 3.94±0.17▲▲ 10 10 6.7±0.6▲▲ 0.79±0.01▲▲ 4.31±0.16▲▲ 与假手术、对照组比较：P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：▲▲P＜0.01 P < 0.05 **P < 0.01 vs control group and Sham group; ▲▲P < 0.01 vs the model group

表 2 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血浆BNP、eNOS活性、NO生成量的影响（x±s ） Table 2 Effects of tetrahydrobiopterin on activities of BNP and eNOS,and NO generating capacity rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s )

与模型组比较，四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组心肌梗死面积更小，见图 1；心肌梗死程度更轻（P＜0.01），见表 3。

图 1 心肌梗死范围的比较 Fig. 1 Comparison on degree of myocardial infarction

表 3(Table 3)

表 3 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死程度的影响（x±s ） Table 3 Comparison on degree of myocardial infarction of rats with myocardial ischemia- reperfusion injury (x±s) 组别 n/例 剂量/(mg·kg-1) 心肌梗死程度/% 模型 9 — 0.24±0.02 四氢生物 9 5 0.16±0.02▲▲ 蝶呤 10 10 0.12±0.01▲▲ 与模型组比较：▲▲P＜0.01 ▲▲P < 0.01 vs the model group

表 3 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死程度的影响（x±s ） Table 3 Comparison on degree of myocardial infarction of rats with myocardial ischemia- reperfusion injury (x±s)

以抗β3肾上腺素受体做抗体，各组均呈阳性。四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组β3表达较模型组明显增强，见图 2。

图 2 心肌组织病理学（DAB染色） Fig. 2 Histopathology of heart tissues (DABstaining)

与对照组比较，模型组β3表达水平下降（P＜0.01）；与模型组比较，四氢生物蝶呤5、10 mg/kg组β3表达水平均升高（P＜0.01），见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠β3表达水平的影响（x±s ） Table 4 Comparison on β3 expression levels in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s) 组别 n/例 剂量/(mg·kg-1) β3表达量 对照 10 — 0.58±0.07 假手术 10 — 0.55±0.06 模型 9 — 0.32±0.06** 四氢生物蝶呤 9 5 0.45±0.02▲▲ 10 10 0.50±0.03▲▲ 与假手术、对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：▲▲P＜0.01 **P < 0.01 vs control group and Sham group; ▲▲P < 0.01 vs model group

表 4 四氢生物蝶呤对心肌缺血再灌注损伤大鼠β3表达水平的影响（x±s ） Table 4 Comparison on β3 expression levels in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury (x±s)

心肌缺血再灌注损伤导致心肌梗死面积扩大，心功能恶化。以往的大量研究集中于收缩功能不全，但是近年来，左心室舒张功能不全受到越来越多的关注。舒张功能不全可单独存在，亦可与收缩功能障碍并存，其在多种疾病的病程中先于收缩功能障碍的出现。为了进一步研究舒张功能不全，本研究观察不同剂量四氢生物蝶呤对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤后舒张功能的影响，并对机制进行了探索。

慢性心衰处于氧化应激状态时，活性氧类物质的产生是增加的（超氧化物、过氧化氢、羟自由基）。当NO与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸盐时，其由有利变为有害。这样，抗氧化应激及增加NO的活性的治疗策略成为慢性心力衰竭患者可能的干预新靶点。缺血再灌注损伤后，活性氧（ROS）生成增多，心肌处于高氧化应激状态，NO生成减少^[1]。本研究发现，与模型组比较，应用外源性5、10 mg/kg四氢生物蝶呤能够显著提高eNOS活性，增加NO生成量，从而改善心肌缺血再灌注损伤。

众所周知，血流动力学指标中，-dp/dt_max表示心室舒张期室内压下降最大速率，LVEDP主要反映左心室的舒张功能，作为心脏前负荷的指标；Tau左室松弛时间常数，作为左室舒张功能评价的金指标；血浆BNP作为心衰的标志物，反映左室的舒张功能及收缩功能。本研究结果发现，与模型组比较，应用外源性5、10 mg/kg四氢生物蝶呤后，降低LVEDP、增高-dp/dt_max，缩小心肌梗死面积，改善左室舒张功能，从而使BNP活性下降。

本研究结果显示，外源性5、10 mg/kg四氢生物蝶呤干预后，可以增加eNOS活性并增加NO生产量，与文献报道结果^[5-6]一致，其机制可能是四氢生物蝶呤增加NOS再耦联，从而提高NOS的活性，促进内源性NO的生成。逆转NOS耦联是一种潜在的治疗心肌功能障碍的新策略^[7-8]。本研究结果显示，在一定剂量范围内，增加四氢生物蝶呤产生的心脏保护效应具有剂量相关性，与Moens等^[9]研究一致。

β3受体对心血管疾病的病理生理具有重要的作用，其功能在心血管系统中越来越受到重视，已经作为治疗心脏病的潜在靶点^[10-11]。β3受体的表达可增加NO生物活性，对心肌缺血再灌注损伤具有保护效应^[12]。本研究结果发现，与模型组比较，增加外源性四氢生物蝶呤，能够提升β3受体在心肌的表达，其机制可能为四氢生物蝶呤不仅是NOS必须辅助因子，而且是酪氨酸生成儿茶酚胺的必须辅助因子^[13]，后者对β3受体具有兴奋激动作用，推测四氢生物蝶呤可能对β3在心肌的表达发挥提升调节作用。

综上所述，四氢生物蝶呤可以减少急性缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积，改善心肌舒张功能，对大鼠急性缺血再灌注损伤具有保护作用，这种作用可能与激活eNOS活性、提高NO生成量和β3受体有关。