70%的非小细胞肺癌患者在最初接受一线化疗方案后病情缓解，提高了患者临床获益率。因此，化疗是非小细胞肺癌患者不可或缺的重要治疗手段。大多数化疗药物抑制肿瘤细胞的同时会影响骨髓细胞的增殖、分化，造成外周正常血细胞释放受到抑制，出现不同程度的白细胞、红细胞、血小板、中性粒细胞降低^[1-3]。该类化疗药物由强到弱的排序依次为烷化剂、抗代谢抗肿瘤药、金属络合物抗肿瘤药物、植物抗微管药和抗肿瘤抗生素^[4]。现代医学常采用集落刺激因子、输成分血、造血干细胞移植等手段治疗骨髓抑制，这些方法起效较快，但有一定的副作用，远期疗效不理想。越来越多的研究表明中医药在改善化疗后的骨髓抑制具有较好的优势^[5-6]。本课题组前期研究认为，化疗后骨髓抑制病机复杂，大多为脏腑虚损，气虚血瘀导致血行不畅，外毒内毒加重正气亏虚，形成恶性循环的过程。以“益气扶正，解毒祛瘀”为治疗原则的消岩汤是本课题组根据十余年治疗肿瘤临床经验、中药功效以及现代药理研究拟定出的中药汤剂，具有益气养阴、祛瘀解毒的功效。前期临床研究显示消岩汤在减轻气虚毒瘀型非小细胞肺癌化疗毒副反应方面具有良好效果^[7]；与单纯化疗比较，消岩汤配合化疗使用对改善骨髓抑制疗效显著^[8-10]。在此基础上，本实验采用消岩汤先期干预治疗骨髓抑制的Lewis肺癌小鼠，分析消岩汤对骨髓微环境相关因素的影响，并探索其作用机制。

SPF级健康近交系C57BL/6小鼠，40只，体质量20～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（军）2012-0004，饲养于天津医科大学肿瘤医院实验动物中心，动物分笼饲养，自由摄食、饮水，室温（20±2）℃，湿度20%～40%。

小鼠Lewis肺癌细胞，天津医科大学肿瘤医院免疫室保存传代。

DMEM培养液、胎牛血清（美国Gibco公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海博谷生物科技有限公司），Cabiur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），CX-10倒置相差显微镜（日本Olympus公司），UNIQ-10 column Trizol总RNA提取试剂盒（Sangon生物技术服务有限公司），Improm II Reverse Transcription System逆转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix实时定量PCR试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司），电泳仪、梯度PCR扩增仪、凝胶图像分析系统、Quantity one图象分析系统，美国Bio-Rad。

消岩汤由天津中医药大学第一附属医院饮片制剂室提供，组方为黄芪30 g、太子参15 g、郁金10 g、姜黄10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蛎各30 g、蜂房15 g，共140 g生药。中药饮片置于圆底烧瓶内，第一煎按料液比1∶10加入蒸馏水，浸泡45 min，煮沸45 min。第二煎按料液比1∶8加入蒸馏水煮沸30 min，滤过，合并两次滤液，水浴中浓缩至300 mL。浓缩液为棕黄色液体，相当于生药量0.42 g/mL。

重组人粒细胞刺激因子注射液，规格75 μg（0.3 mL∶6×10⁶ IU），杭州九源基因工程有限公司生产，产品批号80030。注射用环磷酰胺，规格0.2 g/支，江苏盛迪医药有限公司生产，产品批号0857，溶于10 mL生理盐水中，稀释后质量浓度为20 g/L。

将Lewis肺癌细胞1×10⁶/mL与Matrigel胶混合（与PBS比例为1∶1），并取0.2 mL混悬液接种于C57BL/6小鼠右侧前肢腋部皮下。接种4 d后，以小鼠右腋下皮下可触及肿瘤块标志造模成功。

待肿瘤可见时，将40只Lewis肺癌小鼠随机分为对照组、模型组、重组人粒细胞刺激因子组和消岩汤组，每组各10只。

依据《新药（西药）临床前研究指导原则汇编》^[11]的造模方法。除对照组外，采用环磷酰胺建立小鼠骨髓抑制模型。ip注射用环磷酰胺100 mg/kg（按照小鼠体质量0.02 mL/g剂量，ip 5 mg/mL注射用环磷酰胺溶液），1次/d，连续给药3 d。

根据《药理实验方法学》^[12]“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”R_ab＝12.33，计算消岩汤的小鼠临床等效剂量，小鼠每天的给药剂量＝D_b× R_ab＝2.33 g/kg×12.33＝28.7 mg/g，即2.9 g/mL消岩汤。根据《药理实验方法学》^[10]“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算重组人粒细胞刺激因子的小鼠临床等效剂量，即重组人粒细胞刺激因子注射液15 ng/g。

对照组和模型组ig 0.02 mL/g生理盐水。人粒细胞刺激因子组在造模后sc重组人粒细胞刺激因子注射液15 ng/g，1次/d，连续给药7 d。消岩汤组在造模后ig 2.9 g/mL消岩汤，2次/d，0.2 mL/次，连续给药7 d。

各组小鼠最后一次给药1 h后脱颈处死，无菌取出股骨。用注射器吸取少量培养液，从股骨的一端将骨髓冲到培养皿中，制备单细胞悬液，并调节细胞浓度至2×l0⁵/mL。将细胞接种到细胞培养瓶中，培养体系IMDM培养基含12.5%马血清、12.5%胎牛血清、5 μmol/L氢化可的松、5×10^-4 mol 2-巯基乙醇、青霉素0.1 mL、链霉素0.1 mL，在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度条件下培养。培养液更换：细胞培养至第7天时，全量换液，以后每3天全量换液1次。培养至14～20 d。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，然后再进行传代培养。在倒置显微镜下观察，见细胞稍圆时，立即去胰蛋白酶，加入PBS液3 mL，用吸管反复吹打细胞，使成为单细胞悬液，移入离心管中，1 500 r/min离心5 min，去上清，用振荡器使细胞分散，开始进行检测。

将骨髓基质细胞调整至2×l0⁵/mL，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜。离心收集细胞，以1 mL PBS洗细胞1次，加入500 μL PBS含50 μg/mL碘化丙啶（PI），100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤后上流式细胞仪分析细胞周期。

将细胞悬液体系1 mL接种于24孔培养板中，置37 ℃含7% CO₂饱和湿度的培养箱内孵育，每周半量换液1次，第14天于倒置显微镜下计数，由40个以上成纤维细胞组成的集落为1个成纤维细胞集落生成单位（CFU-F）。

采用QRT-PCR法检测骨髓细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的基因表达。总RNA提取试剂盒和DNA第一链合成试剂盒均购自北京通瑞生物有限公司。RNA完整性采用琼脂糖凝胶电泳检测，其透过率、纯度采用紫外分光光度计检测。以Oligo-dT15为引物，参照20 μL反应体系合成cDNA第一链。引物序列由北京通瑞生物有限公司合成并提供。反应条件为95 ℃预变性10 s、95 ℃ 5s、64 ℃ 34s，40个循环。每对引物设3个复孔。结果用ABI PRISM 7500分析，融解曲线特异。无引物二聚体和非特异性扩增。ABI PRISM 7500自动生成C_T值。

 引物：Bcl-2 mRNA

（sense）：5'-GACAGAAGATCATGCCGTCC-3'，

（antisense）：5'-GGTACCAATGGCACTTCAAG-3'

 Bax mRNA

（sense）：5'-CTGAGCTGACCTTGGAGC-3'

（antisense）：5'-GACTCCAGCCACAAAGATG-3'

采用SPSS 22统计软件处理，实验数据采用x±s表示，组间比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析。

与对照组比较，模型组骨髓细胞阻滞于G₀/G₁期（P＜0.05）；与模型组比较，消岩汤能够促进骨髓细胞从G₀/G₁期向S、G₂/M期转化（P＜0.05），从而促进细胞增殖，缓解化疗导致的骨髓的抑制程度，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 消岩汤对骨髓细胞周期的影响（x±s，n = 10 ） Table 1 Effect of Xiaoyan Decoction on bone marrow cell cycles (x±s,n = 10) 组别 剂量 G0/G1/% S/% G2/M/% 对照 — 64.88±2.10 17.10±0.19 18.74±0.45 模型 — 75.17±0.50 11.23±0.49 13.62±0.42 重组人粒细胞刺激因子 15ng·g-1 52.81±1.96# 23.38±0.94# 24.71±0.59# 消岩汤 2.9g·mL-1 68.73±1.25# 16.49±0.56# 17.25±0.36# 与对照组比较：P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 P< 0.01 vs control group; #P< 0.05 vsmodel group

表 1 消岩汤对骨髓细胞周期的影响（x±s，n = 10 ） Table 1 Effect of Xiaoyan Decoction on bone marrow cell cycles (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组能明显抑制骨髓基质细胞CFU-F的形成（P＜0.05）；与模型组比较，消岩汤能一定程度上缓解化疗导致的CFU-F形成减少（P＜0.05），见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 消岩汤对CFU-F的影响（x±s，n = 10 ） Table 2 Effect of Xiaoyan Decoction on CFU-F (x±s,n = 10) 组别 剂量 CFU-F 对照 — 55.30±2.98 模型 — 42.50±3.03 重组人粒细胞刺激因子 15ng·g-1 49.30±2.75# 消岩汤 2.9g·mL-1 54.20±4.64# 与对照组比较：P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 P< 0.01 vs control group;#P< 0.05 vsmodel group

表 2 消岩汤对CFU-F的影响（x±s，n = 10 ） Table 2 Effect of Xiaoyan Decoction on CFU-F (x±s,n = 10)

与对照组比较，模型组骨髓细胞Bcl-2 mRNA表达较少；与模型组比较，消岩汤能上调抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达（P＜0.05），减少骨髓抑制小鼠骨髓细胞的凋亡，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 消岩汤对骨髓细胞凋亡基因mRNA相对表达水平的影响（x±s，n = 10 ） Table 3 Effect of Xiaoyan Decoction on express level on apoptosis gene mRNA of bone marrow cells (x±s,n = 10) 组别 剂量 mRNA表达水平 Bcl-2 Bax 对照 — 0.99±0.14 1.10±0.30 模型 — 0.81±0.10 1.12±0.32 重组人粒细胞刺激因子 15ng·g-1 1.14±0.15# 0.82±0.13# 消岩汤 2.9g·mL-1 1.48±0.34# 0.97±0.22 与对照组比较：P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 P<0.01 vs control group; #P <0.05 vs modelgroup

表 3 消岩汤对骨髓细胞凋亡基因mRNA相对表达水平的影响（x±s，n = 10 ） Table 3 Effect of Xiaoyan Decoction on express level on apoptosis gene mRNA of bone marrow cells (x±s,n = 10)

微环境提供造血细胞形成生长的场地，发挥造血细胞增殖、分化、成熟和释放的作用。大量研究发现造血微环境障碍直接影响造血细胞的功能和结构。因此重建损伤的造血微环境对于恢复造血功能的紊乱十分重要。研究发现重组人类粒细胞集落刺激因子明显改善化疗导致的中性粒细胞缺乏症^[13]，但有一定的不良反应。近年来关于中药改善化疗所致的骨髓抑制临床研究及实验研究有一定的成效。放化疗可使骨髓细胞停滞在G₀/G₁期，诱导骨髓细胞向增殖细胞转化，可促进受损的骨髓细胞增殖分化。郑轶峰等^[14]研究表明，左归丸可能通过促进造血细胞由G₀期转化至细胞周期，恢复因放化疗受损的骨髓造血细胞各个周期受损的DNA，加速增殖和分化，从而促进骨髓造血功能的重建。Bcl-2和Bax基因是凋亡家族中重要的凋亡调节基因。在正常骨髓细胞，未成熟的增殖的造血祖细胞和未分化的造血前体细胞均有Bcl-2表达，Bax基因增加细胞凋亡的敏感性，加速骨髓细胞凋亡^[15]。研究表明，黄芪注射液抑制凋亡蛋白Bcl-XL表达，减少骨髓细胞凋亡以促进造血干、祖细胞的增殖分化^[16]。本研究发现骨髓抑制小鼠模型组Bcl -2 mRNA表达降低（P＜0.05）。

本实验研究结果显示，骨髓抑制模型组使骨髓抑制小鼠骨髓细胞在G₀/G₁期阻滞，消岩汤提前给药后G₀/G₁细胞减少，S、G₂/M期细胞增加。提示消岩汤通过调节细胞凋亡相关因素的表达，共同调控细胞周期进入下一个周期，促进细胞向增殖周期转化。消岩汤预防给药上调Bcl-2 mRNA表达，从而减少骨髓抑制小鼠骨髓细胞的凋亡，从而促进骨髓细胞的增殖分裂，达到恢复骨髓造血功能的目的。