卡铂是第2代金属铂类抗肿瘤药物，具有抗肿瘤活性强、毒性低等特点，是周期非特异性抗肿瘤药物，直接作用于脱氧核糖核酸（DNA），从而抑制分裂旺盛的肿瘤细胞。其肾毒性轻微且不常见，耳毒性和神经毒性罕见，骨髓抑制比顺铂强，是剂量限制性毒性。目前临床主要用于治疗实体瘤，如小细胞肺癌、卵巢癌、睾丸肿瘤、头颈部癌及恶性淋巴瘤等；也适用于其他肿瘤，如子宫颈癌、膀胱癌及非小细胞癌等^[1]。血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，能与大量内源和外源性药物发生相互作用，是重要的载体蛋白。药物分子进入体内后，与血清白蛋白结合，进而在血浆中储存、运输，从而到达靶部位，发挥其药理作用^[2]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）常作为模型蛋白用于研究药物与白蛋白相互作用。通过研究药物与BSA相互作用的热力学特征，测定BSA荧光强度、峰位和荧光寿命的变化等来探索药物与BSA相互作用机制、BSA构型的变化及药物的药理作用。本实验采用荧光光谱法和同步荧光光谱法，在模拟人体生理条件下，探讨卡铂对BSA的荧光猝灭机制、结合常数、结合位点数、作用力类型和两者相互作用后对BSA构象的影响。

F-7000荧光光度计（日本日立公司）；电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；GR-202型电子天平（日本AND公司）；Biohit加样器（芬兰百得公司）；pHS-3C数字酸度计（上海光学仪器厂）。

BSA（美国Sigma公司，质量分数≥99%，平均相对分子质量68 000）；卡铂（上海哈灵生物科技有限公司，质量分数≥98%，批号100322-201102）；其他试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

用PBS缓冲溶液将BSA配制成1.16×10^-5 mol/L储备液，用PBS缓冲溶液将卡铂配制成15.8 μmol/L溶液，分别在系列10 mL量瓶移取1.0 mL BSA溶液和不同体积（0、10、20、30、40、50、60 μL）卡铂溶液，用PBS缓冲溶液加至刻度，混合均匀，分别置于恒温（298、303、308 K）水浴中30 min。准确移取3 mL混合溶液于石英比色皿中，以280 nm为激发波长，在荧光光度计上记录290～500 nm波长范围内的发射光谱，即得荧光光谱。测定308 K待测液，分别在△λ＝15、60 nm下扫描荧光激发光谱，得到BSA中酪氨酸残基和色氨酸残基的同步荧光光谱。

BSA具有较强的内源性荧光，主要由分子中的酪氨酸残基（Tyr）、色氨酸残基（Trp）和苯丙氨酸残基（Phe）产生^[3]。固定BSA浓度，测定不同浓度的卡铂与BSA相互作用的荧光光谱，见图 1。可见随着卡铂浓度的增加，BSA的荧光强度有规律地降低，其峰形基本不变，但是最大荧光峰的峰位发生明显红移。表明卡铂与BSA发生相互作用，使BSA分子中荧光基团及其所处微环境发生改变，推测卡铂与BSA结合形成不发光的荧光复合物。

图 1 308 K时卡铂对BSA荧光猝灭图 Fig. 1 Fluorescence spectra of cisplstin on BSA at 308 K

荧光猝灭是不同的分子间相互作用，导致荧光基团的荧光量子化产率减少，缩短发光分子激发态寿命^[4]。药物小分子对BSA猝灭机制主要是静态猝灭和动态猝灭两种^{[5, 6]}。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生碰撞，引起荧光物质减弱的过程，引起动态猝灭的主要原因是电子转移和分子间的有效碰撞，温度升高加速分子间的有效碰撞，使动态猝灭常数增加；对于静态猝灭过程，随着温度升高，基态复合物的稳定性降低，猝灭常数会随之减小。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程^[7]：

(1)

F₀和F分别为加入卡铂之前和加入卡铂之后BSA的荧光强度，K_q是双分子猝灭速率常数，τ₀为卡铂不存在时荧光物质的平均寿命，生物大分子荧光平均寿命大约为1×10⁻⁸ s，K_sv是动态猝灭常数，[Q]为卡铂的浓度。以F₀/F对卡铂浓度[Q]作图，见图 2。

图 2 卡铂对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer图 Fig. 2 Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of cisplstin on BSA

考察298、303、308 K温度下动态猝灭常数K_sv和K_q，结果见表 1。可见随着温度的升高，卡铂与BSA的K_sv逐渐减小，初步判断卡铂对BSA的猝灭机制是静态猝灭。此外卡铂对BSA的荧光猝灭速率常数K_q远大于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭常数2.0×10¹⁰ L/(mol∙s)^[8]，进一步证明卡铂对BSA的猝灭不是由于分子间碰撞和能量转移而导致的动态猝灭，而是由于两者形成复合物而导致内源性荧光猝灭的静态猝灭。

表 1(Table 1)

表 1 卡铂与BSA的Stern-Volmer常数 Table 1 Stern-Volmer constants of cisplstin with BSA t/K Ksv/(L·mol−1) Kq/(L·mol−1·s−1) K/(L·mol−1) n 298 1.53×104 1.53×1012 6.82×103 1.05 303 1.27×104 1.27×1012 7.54×103 1.07 308 1.08×104 1.08×1012 9.81×103 1.11

表 1 卡铂与BSA的Stern-Volmer常数 Table 1 Stern-Volmer constants of cisplstin with BSA

静态猝灭是猝灭剂与荧光分子之间相互作用形成基态复合物，而导致荧光强度降低的过程。卡铂对BSA的猝灭机制为静态猝灭，可以用静态猝灭公式得到结合常数和结合位点数^[9]。

(2)

F₀和F分别为加入卡铂之前和加入卡铂之后BSA的荧光强度，K为卡铂与BSA的结合常数，n为卡铂与BSA的结合位点数，[Q]为卡铂的浓度。以lg（F₀－F）/F对lg[Q]作图，得到不同温度（298、303、308 K）下卡铂与BSA的结合常数和结合位点数，结果见表 1。可见卡铂与BSA的结合位点数均接近1，表明卡铂与BSA有1个结合位点；结合常数均很大，说明卡铂与BSA之间作用力很强。

药物小分子与蛋白质大分子相互作用力包括氢键、静电引力、范德华力、疏水作用力等^{[10, 11, 12]}。根据生物大分子与小分子作用力类型热力学规律^{[13, 14]}：即△H＜0，△S＜0为氢键、范德华力；△H＞0，△S＞0为典型的疏水作用力；△H＜0，△S＞0主要存在静电引力。当温度变化不大的情况下，焓变可看作一个常数。根据卡铂与BSA作用前后的焓变和熵变的相对大小，确定两者的作用力类型。

(3)

(4)

(5)

由热力学公式（3）～（5）可以计算得到不同温度下卡铂与BSA作用的热力学参数，结果见表 2。可见△H＞0，△S＞0，说明卡铂与BSA以疏水作用力为主。△H＞0，说明卡铂与BSA作用过程为吸热反应，温度升高有利于反应的进行，从而使结合常数随之增大。

表 2(Table 2)

表 2 卡铂与BSA结合热力学常数 Table 2 Thermodynamic parameters for binding of BSA with cisplstin t/K △rHm/(kJ·mol−1) △rGm/(kJ·mol−1) △rSm/(J·mol−1·K−1) 298 27.73 −21.86 166.41 303 27.73 −22.48 171.99 308 27.73 −23.52 168.48

表 2 卡铂与BSA结合热力学常数 Table 2 Thermodynamic parameters for binding of BSA with cisplstin

BSA中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸能吸收紫外光，并且能发射内源性荧光，而内源性荧光主要来自色氨酸和酪氨酸。可以通过检测BSA中色氨酸和酪氨酸残基荧光变化，考察药物小分子对BSA构象的影响。固定△λ＝60 nm得到BSA中色氨酸残基的同步荧光光谱；△λ＝15 nm得到BSA中酪氨酸残基的同步荧光光谱，见图 3。

图 3 卡铂与BSA作用的同步荧光光谱图 Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between cisplstin and BSA

氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关，如果红移说明残基所处环境极性增加，疏水性减弱，因此可以根据发射波长的移动（红移或者蓝移）来判断BSA构象的变化^[15]。△λ＝15 nm时，随着卡铂浓度的增加，BSA的酪氨酸残基荧光有规律地降低，但降低不明显，且最大荧光发射波长未发生明显移动，说明卡铂的加入对酪氨酸残基微环境没有明显影响；△λ＝60 nm时，BSA的色氨酸残基荧光明显降低且比酪氨酸残基荧光强度降低更明显，表明BSA的荧光主要由色氨酸残基贡献，推测卡铂与BSA的结合位点更接近于色氨酸残基。色氨酸的最大发射波长发生红移，表明卡铂加入改变BSA色氨酸残基的微环境，使BSA色氨酸残基亲水性增强，疏水性环境减弱，说明BSA的构象发生变化。

采用荧光光谱法研究卡铂与BSA相互作用，结果表明卡铂对BSA有荧光猝灭作用，是由于两者形成1∶1的复合物而引起的静态猝灭。结合常数随温度的升高而增大，可能是由于温度的升高使卡铂与BSA分子之间的碰撞和扩散增强，导致结合常数的增大。同步荧光结果表明：卡铂的加入使BSA色氨酸氨基附近的微环境发生改变，其亲水性增强，疏水性环境减弱；卡铂与BSA的结合位点在色氨酸残基附近，BSA的构象发生变化。

BSA的空间结构是圆筒状结构，分子中几乎所有的疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部，构成疏水腔，此空间结构靠疏水性作用力来维持^[16]。实验结果表明卡铂与BSA之间以疏水作用为主，说明卡铂通过疏水作用力进入BSA疏水空腔内部形成复合物。