2016, Vol. 31
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2016.12.045 |
近年来，血栓栓塞性疾病的发病率呈不断上升趋势，且表现出致死率高和致残率高的特点。抗血小板药物通过抑制血小板聚集，防止血栓形成，在该类疾病的预防和治疗中发挥重要作用。根据作用靶点的不同，常用抗血小板药物主要包括环氧合酶（COX-1）抑制剂（如阿司匹林）、P2Y12抑制剂（如氯吡格雷）以及血小板GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂（如阿昔单抗）等。然而，大量临床研究表明上述药物的有效性和安全性存在不足。因此开发结构新颖、安全性和有效性更佳的抗血小板药物已成为该领域研发的重要目标。
1991年，Coughlin等[1]首先克隆了人体血小板凝血酶受体（thrombin receptor），并揭示了该受体被凝血酶激活的独特机制，这为抗血栓药物的研发提供了新的靶标。由于凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，凝血酶受体也因此被称为蛋白酶激活受体-1（protease-activated receptor-1，PAR-1），后续研究又相继发现PAR-2、PAR-3、PAR-4等亚型。研究表明，凝血酶通过PAR-1、PAR-4介导人体的血小板活化，其中PAR-1起主要作用[2-3]。因此，凝血酶受体拮抗剂的开发主要以PAR-1为作用靶点。目前已有多个拮抗剂被报道，其中口服小分子药物vorapaxar sulfate已上市，多肽类药物PZ-128正在进行II期临床试验。
PAR-1由染色体F2R基因编码，其一级结构由425个氨基酸残基构成。该受体C-端位于细胞内，N-端位于细胞外，其二级结构还包括7个跨膜螺旋结构域（TM1-7）、3个细胞内loop区（intracellular loop，ICL1-3）和3个细胞外loop区（extracellular loop，ECL1-3）。PAR-1的活化是一种特殊的、不可逆的“自身激活”过程[1]。具体而言，凝血酶首先特异性识别PAR-1的水蛭素样序列（K51YEPF55），该序列对两者的结合中发挥至关重要的作用[4]。然后，位于PAR-1上的N端序列41Arg-42Ser（R41-S42）被凝血酶水解，肽键断裂并暴露出一个起始序列为S42FLLRN47的新N端。最后，该末端作为一个“栓配体”（tethered ligand）与自身胞外loop区ECL2发生分子内反应，促使PAR-1构象发生改变，进而引发细胞内的信号级联放大反应，最终导致血小板的聚集，见图 1。
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图 1 PAR-1的活化机制 Fig. 1 Mechanism of PAR-1 |
按结构特点，PAR-1拮抗剂可分为小分子拮抗剂和多肽类拮抗剂两大类。
1 小分子PAR-1拮抗剂目前已报道的PAR-1小分子拮抗剂包括vorapaxar、atopaxar、F16618、F16357、ML161等。vorapaxar在2014年5月被FDA批准上市，主要用于有心脏病发作史患者以及动脉栓塞患者，以降低心脏病进一步发作、中风等死亡危险；atopaxar的临床研究主要针对患有急性冠状动脉综合症（acute coronary syndrome，ACS）或高危冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）的患者，但遗憾的是其Ⅱ期临床试验已宣告终止；F16618、F16357、ML161仍处在临床前研究阶段。
1.1 vorapaxarvorapaxar商品名为Zonitivity，是先灵葆雅公司基于天然产物himbacine结构改造后首创的口服、选择性、竞争性PAR-1拮抗剂。临床前研究表明：vorapaxar在体外可有效抑制由10 nmol/L凝血酶和15 μmol/L高亲和力凝血酶受体活化肽（high affinity thrombin receptor actived peptide，haTRAP）诱导的血小板聚集反应（IC50分别为47、25 nmol/L）。但该药对其他血小板活化剂如ADP、胶原蛋白、PAR-4活化肽和血栓烷素模拟物U46619诱导的血小板聚集反应无明显影响[5]。
Ⅰ期和Ⅱ期的临床试验结果表明，vorapaxar可有效降低心肌梗死的发生率，且未导致中重度出血等不良反应[6-8]。随后开展的Ⅲ期临床试验分别评价了vorapaxar联用阿司匹林和氯吡格雷对ACS患者的有效性和安全性（TRA·CER试验）和vorapaxar作为动脉粥样硬化疾病二级预防辅助药物的有效性和安全性（TRA 2P-TIMI 50试验）。然而，两项临床试验均发现vorapaxar组出现了更多的出血事件，颅内出血风险也有所上升。尽管如此，vorapaxar还是表现出一定疗效：在TRA·CER试验中，治疗组的心肌梗死发生率明显下降（11.1% vs 12.5%，P＜0.05）；而在TRA 2P-TIMI 50试验中，包括心血管原因死亡、心肌梗死和中风在内的主要临床终点发生率也明显降低（9.3% vs 10.5%，P＜0.001），次要终点发生率也有所下降[9-10]。基于上述试验结果，vorapaxar于2014年被FDA批准上市，成为首个作用于PAR-1靶点的口服抗血栓药物。
最近Chelliah等[11-12]报道了一系列vorapaxar衍生物1～3，与vorapaxar比较，这些化合物对PAR-1的体外拮抗活性相当或稍强，药动学性质有所改善。Knight等[13]对C-9位置进行了羰基化，得到化合物4，该化合物表现出接近于Vorapaxar的体外PAR-1拮抗活性。见图 2。
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图 2 vorapaxar及其衍生物 Fig. 2 Structures of vorapaxar and derivatives |
1.2 atopaxar
atopaxar又名E5555，是由日本卫材株式会社开发的可逆性口服PAR-1拮抗剂，结构见图 3。该化合物经CYP3A4代谢，通过胃肠道消除[14]。临床前研究表明atopaxar可强效抑制凝血酶和凝血酶受体激活肽（TRAP）诱导的血小板聚集反应（IC50分别为0.064、0.031 μmol/L）[15]。Ⅰ期临床试验证实atopaxar在各个治疗组的有效性，且并未发生明显的出血不良反应。后续开展的4项Ⅱ期临床试验评价了atopaxar应用于ACS和CAD患者的安全性。结果表明，治疗组和安慰剂组在总出血概率方面未呈现统计学差异。相对于安慰剂组，治疗组总的主要心血管不良事件发生概率也未有增加。然而，在各项试验的高剂量组，均发现了肝功异常和QT间期延长的现象，且该药缺乏明确的量效关系[16-18]，因此日本卫材株式会社已终止了atopaxar的开发。
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图 3 atopaxar的结构 Fig. 3 Structure of atopaxar |
1.3 F16618和F16357
F16618、F16357是由法国Pierre Fabre研究中心基于肉桂哌嗪结构开发的PAR-1拮抗剂，结构见图 4。体外活性测试表明F16618、F16357可有效抑制TRAP诱导的人血小板聚集反应。为进一步证明化合物的体内活性，研究者构建了大鼠的体外动静脉分流模型，以TRAP诱导的血小板聚集抑制率和血管堵塞时间增加率为指标，分别评价经静脉给药（1.25 mg/kg）和口服给药（40 mg/kg）后化合物的抗血小板聚集活性。结果表明，相对于对照药atopaxar（pKb＝8.18），F16618（pKb＝5.30）、F16357（pKb＝5.52）均略低。但是，两者更有效地延长了堵塞时间。总之，在该模型中，F16618、F16357均表现出一定的抗血栓活性[19]。此外，F16618、F16357对PAR-1具有一定的选择性，且对出血时间没有明显影响。加之F16618、F16357的药动学性能良好，合成简单，使其具有一定的开发潜能。
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图 4 F16618和F16357结构 Fig. 4 Structures of F16618 and F16357 |
1.4 ML161
2012年，Dockendorff等[20]通过高通量筛选发现了新型PAR-1拮抗剂ML161。构效关系研究表明，化合物结构中的1,3-苯二胺骨架对活性发挥着关键的影响，结构见图 5。体外PAR-1拮抗活性测试表明，ML161能够显著抑制由TARP诱导的人血小板表面P-selectin蛋白的表达，且对PAR-1具有一定的选择性。此外，ML161可能以一种全新的“别构调节”机制拮抗PAR-1，即选择性调节下游的G蛋白信号通路。在TARP诱导的人血小板聚集反应测试中，研究者发现ML161仅抑制了血小板的分泌反应，对血小板形状改变没有影响[20]。这种独特的作用机制有可能减少临床应用上出血等不良反应的发生，值得后续深入研究。
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图 5 ML161的结构 Fig. 5 Structure of ML161 |
2 多肽类PAR-1拮抗剂
多肽类拮抗剂包括RWJ-58259、PZ-128等。RWJ-58259是早期研发的PAR-1选择性拮抗剂，目前主要作为生物探针应用于PAR-1领域的研究；PZ-128由塔芙茨医疗中心开发，目前正处于临床Ⅱ期试验阶段。
2.1 RWJ-58259RWJ-58259是由强生公司研发的一种选择性PAR-1拮抗剂，结构见图 6。在人体血小板的体外活性测试中，该药可强效抑制由凝血酶介导的血小板活化作用（IC50＝0.37 μmol/L）。在非人类灵长类动物血栓形成模型中，RWJ-58259也能产生有效的抑制效果。然而，人肝微粒体代谢测试发现，RWJ-58259的半衰期（t1/2）仅为9.2 min；大鼠静脉给药后的t1/2也仅为19.2 min[21]。药动学性质的缺陷使得RWJ- 58259的研究止步于临床前研究。目前，该化合物主要作为生物探针应用于相关方面。
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图 6 RWJ-58259及其衍生物的结构 Fig. 6 Structures of RWJ-58259 and derivatives |
近期，Robinson等[22]合成了一系列RWJ-58259的类似物，见图 6，旨在保留化合物活性的同时改善其药动学性质。研究者首先通过计算机模拟，预测出RWJ-58259的代谢活性位点；随后在活性位点引入不同基团，以“封闭”活性位点，减少化合物的代谢分解。最终，经细胞内Ca2+水平测试，研究者发现了与RWJ-58259活性相当或稍强的化合物5～10，同时这些化合物的代谢稳定性也得到改善。
2.2 PZ-128PZ-128是由塔芙茨医疗中心开发的一种高效、可逆转的新型PAR-1拮抗剂，该药的结构来源于靶点蛋白ICL3和TM6之间的氨基酸序列，见图 7。
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图 7 PZ-128的结构 Fig. 7 Structure of PZ-128 |
该区域在PAR-1与G蛋白之间信号转导中发挥重要作用[23]。实验证明，PZ-128可迅速高效地定位于细胞膜表面，并穿过磷脂双分子层进入细胞内部，通过稳定或模拟非活性状态下的PAR-1，进而抑制激活态PAR-1介导的血小板聚集。该机制完全不同于传统PAR-1拮抗剂的作用方式，因此PZ-128有望成为治疗冠状动脉疾病的新型药物[24]。临床前研究证明PZ-128经静脉注射可迅速起效，抑制PAR-1介导的血小板聚集以及动脉血栓生成，且与氯吡格雷有着强烈的协同效应。
PZ-128的Ⅰ期临床试验旨在评价该药对CAD患者的有效性、安全性以及药动学性质[25]。研究表明PZ-128对由TRAP（8 μmol/L）诱发的血小板聚集效应抑制效果明显，且呈现出剂量相关性。此外，该药能够专一性地抑制PAR-1诱导的血小板聚集反应，对ADP、胶原蛋白诱导的血小板聚集反应无抑制作用。而且PZ-128对凝血、心电图等重要参数未产生明显影响。目前PZ-128的Ⅱ期临床试验正在进行，以进一步评价其针对非紧急经皮冠状动脉介入治疗（PCI）患者的有效性和安全性。
3 小结针对PAR-1的作用机制及其拮抗剂的研究已取得较大进展。vorapaxar作为首个被批准的口服小分子PAR-1抑制剂，已被用于有心脏病发作史患者以及动脉栓塞患者。但出血风险增加等不良反应限制了该药物的进一步应用。而新近出现的多肽类拮抗剂PZ-128在保留了抗血小板活性的同时表现出专一性强、安全性好等优点。相信在不久的将来，经过广大药学工作者的艰苦努力，更加安全有效的新型PAR-1拮抗剂一定能用于临床，造福广大患者。
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