三九膏系天津市公安医院的医院制剂，多年来以治疗咳喘有良好疗效而备受患者青睐。全方以白芥子、元胡、沉香、细辛、甘遂等中药组成，且以其君药白芥子中含有的芥子碱硫氰酸盐为主要有效成分治疗咳喘等呼吸道疾病，作用强烈^[1]。本实验以大鼠皮肤模拟人的皮肤研究三九膏的体外透皮吸收性质和规律，为三九膏在体透皮吸收规律研究提供参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

改良Franz扩散池、7k-208型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司），KH3200B超声清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司），LC-20A高效液相色谱（日本岛津）、RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂

三九膏药粉、阴性对照药粉，规格6 g/盒，均由天津市公安医院提供。芥子碱硫氰酸盐对照品，批号111702-201102，由中国食品药品检定研究院提供。甲醇（色谱纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）、磷酸二氢钾（分析纯，天津市江天化工技术有限公司）、乙腈（色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司）、屈臣氏蒸馏水。

1.3 实验动物

SD大鼠，雄性，20只，体质量250～300 g，由天津实验动物中心提供，动物使用许可证号SYXK（津）2011-0008，生产合格证号201400603。

2 方法与结果 2.1 芥子碱的HPLC法测定 2.1.1 色谱条件^[2]

Kromasil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.08 mol/L磷酸二氢钾（20∶80）；检测波长：326 nm；体积流量：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：室温。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取减压干燥至恒定质量的芥子碱硫氰酸盐对照品2.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并加至刻度，制成含芥子碱硫氰酸盐0.2 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

取三九膏粉末1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，超声提取20 min，滤过，滤渣再用甲醇同法提取3次，合并滤液。减压回收溶剂至25 mL，即得供试品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.1.4 阴性样品溶液的制备

取不含白芥子的阴性样品药粉，照供试品溶液的制备项下方法操作，即得。

2.1.5 专属性试验

分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，进样测定，见图 1。结果阴性样品对测定无干扰。

2.1.6 线性范围考察。

取对照品溶液，稀释制成质量浓度分别为57.000、28.500、14.250、7.125、3.563、1.781 μg/mL系列对照品溶液，分别精密移取10 μL，进样分析，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝1.08×10⁹ X－1.36×10⁵，R²＝0.999 5，结果表明白芥子碱硫氰酸盐在1.781～57.000 μg/mL线性良好。

2.1.7 精密度试验

精密移取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算得RSD值为0.29%。

2.1.8 稳定性试验

精密移取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h进样10 μL，测定芥子碱硫氰酸盐峰面积值，计算得RSD值为0.29%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验

取同一批样品6份，制备供试品溶液，进样测定，计算芥子碱硫氰酸盐的质量分数，结果其RSD值为1.53%。

2.1.10 加样回收率试验

取同一批样品6份，分别加入芥子碱硫氰酸盐对照品1.00、1.10、1.20 mg，制备供试品溶液，测定，计算回收率，结果芥子碱硫氰酸盐的平均回收率为99.42%，RSD值为1.72%。

2.2 离体皮肤的制备

SD大鼠禁食24 h，处死，除净毛，取后背部皮肤，除去皮下脂肪和筋膜、血管，用生理盐水洗至无浑浊即可，用塑料薄膜包好，置于冰箱中4 ℃冷藏备用。

2.3 样品的制备

将本处方除白芥子外6味药材粉碎过40目筛，按等量递增法混匀，另将生姜熬成汁，加甘油、姜汁适量调成糊状1.2 g/份（干药粉0.6 g），作为空白组。将本处方全方7味药同空白组制备方法制备成1.2 g/份糊状（干药粉0.6 g），备用。试验组平行3组，编号分别为1、2、3。

2.4 体外透皮吸收试验^[3]

采用改良Franz扩散池，将鼠皮用生理盐水冲洗干净，固定，角质层朝上，真皮一侧与接受液接触，接好样品室，接受室中加入生理盐水（接收介质），排尽气泡，在样品室中加入三九膏，封好上端敞口。将安装好的Franz扩散池置于（37±1）℃中搅拌，采用循环水浴保温，磁力搅拌器搅拌速度为200 r/min。编号1、2、3组均在2、4、6、8、10、12 h分别用注射器吸取尽接收液，同时补充等体积等温的生理盐水，排尽气泡后继续实验。接收液均过0.45 μm微孔滤膜，置于EP管，备用。精密量取上述各样品接收液续滤液10 μL进样测定，计算累积渗透率（Q），结果见表 1。

Q＝C_nV/M

C_n是各时刻接收液中白芥子碱硫氰酸盐的质量浓度，V是扩散池接收室的体积（V＝7 mL），M是加在扩散池载药室的白芥子碱硫氰酸盐的总量（M＝0.766 mg）

2.5 体外透皮吸收规律研究^[4]

以累积渗透率与时间拟合零级动力学模型、威布尔模型、希古契模型、Ritger-Peppas模型、单指数模型、双指数模型，并以各模型拟合方程的R²值、AIC值以及拟合绝对偏差和相对偏差确定三九膏体外释放的最佳拟合模型，见表 2。比较各模型方程的R²值、AIC值可知，希古契模型的R²值最大为0.999 1、AIC最小为-3.11，故其为三九膏最佳拟合模型，即三九膏的体外透皮吸收规律符合希古契模型。

3 讨论

三九膏在贴治过程中，由于患者的个体差异，会出现皮肤过敏的不良反应。贴治时间越长，发生的过敏反应越严重。实验结果显示，三九膏中芥子碱硫氰酸盐12 h的累积渗透率在22%左右。由于三九膏的制作工艺以及剂型的限制，造成了三九膏中芥子碱硫氰酸盐的累积渗透率不高。因此，为更好地提高三九膏的治疗疗效，需要进行处方改进，拟加入促透剂或做成新的剂型来提高透过率，缩短贴治时间，减少不良反应的发生，因此本研究为药物新剂型的设计和开发提供了依据。

数据结果显示，三九膏中芥子碱硫氰酸盐的最大透过量在4 h。三九膏在临床治疗中，成人的贴敷时间是8～10 h，儿童的贴敷时间是4～6 h。从研究结果来看，芥子碱硫氰酸盐累积透过量在时间上与临床治疗贴敷时间相吻合，因此本研究为三九膏临床治疗确定最适宜贴治时间提供了依据。