清解方为广西中医药大学第一附属医院儿科李伟伟主任医师挖掘整理的经验方，该方源于广西壮乡民间，全方由岗梅根、千里光、一点红、桑叶组成，具有疏风清热、解毒利咽的功效，在临床用于治疗小儿呼吸系统炎症，已有十多年的应用经验，疗效确切。清解方原方为水煎汤剂，味苦，小儿服用的依从性不高。雾化吸入治疗是利用射流原理，将水滴撞为微小雾滴悬浮于气体中，形成气雾剂输入呼吸道内到达作用部位。对于呼吸系统疾病患者，雾化给药与其他给药方式相比，可达到较高的局部药物浓度，减少全身不良反应。随着技术的进步，近年来超声雾化吸入给药已经成为治疗呼吸系统疾病的常用手段之一。清解方雾化吸入剂能将药物确切地输送到患儿的呼吸系统，避免中药难煎味苦的缺点，已经在临床上取得明确的疗效^[1]。但清解方雾化吸入剂尚无明确的药效学研究基础，因此本研究利用急性炎症动物模型，对清解方雾化吸入剂的抗炎作用进行评价，为其临床应用提供科学依据。

60只雄性KM小鼠，清洁级，体质量18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心，动物使用许可证号SCKX（桂）2009-0002，动物批号0006696。

清解方雾化吸入剂由广西中医药大学第一附属医院药剂科采用水提醇沉法制备，临床应用剂量的20倍浓缩液以制备溶液所用生药材计，质量浓度为含生药11.52 g/mL。将净选后的岗梅根、千里光、一点红、桑叶加水煎煮两次，合并煎煮液，浓缩后加95%乙醇，滤过，收集滤液，回收乙醇至药液无醇味，加NaOH调至pH 7.0，调整浓度后灌装，高压灭菌后备用。吸入用布地奈德混悬液（规格1 mg/支，AstraZeneca Pty Ltd.，批号314665）；地塞米松磷酸钠注射液（规格2 mg/支，河南润弘制药股份有限公司，批号1402222）。

伊文思兰（上海化学试剂采购供应站分装厂，批号11-05-19）；角叉菜胶（美国Sigma进口分装，批号069k0023）；一氧化氮（NO）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20150513）；前列腺素E2（PGE2）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号C0534480121）；白介素-1β（IL-1β）ELISA测定试剂盒（批号201412117）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA测定试剂盒（批号201412119）均为R&D公司进口分装产品；二甲苯（分析纯，上海试剂一厂，批号20130101）。

WH-2000型超声波雾化器（广东粤华医疗器械厂有限公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；EL-204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

动物适应性饲养2 d，随机分为模型组、吸入用布地奈德混悬液（5 mg/kg）组和清解方雾化吸入剂4.6、9.2、18.4 g生药/kg组，每组12只。除模型组给予生理盐水外，其余均给予相应药物，2次/d，20 min/次，连续超声雾化7 d。

超过8倍临床剂量后，药液无法正常雾化，因此清解方雾化吸入剂各剂量组分别对应8、4、2倍的临床剂量。

参考陈奇的实验方法^[2]。第8天上午给药后45 min，各组动物右耳滴0.02 mL二甲苯致炎，15 min后脱颈椎处死，打孔器打下耳片，称定质量。以两耳片质量差值作为肿胀度，以模型组肿胀度明显出现认定为造模成功，计算抑制率。

肿胀度＝致炎耳（右耳）耳片质量－正常耳（左耳）耳片质量

抑制率＝（模型组肿胀度－给药组肿胀度）/模型组肿胀度

动物分组及给药同2.1项下，同时加设对照组。对照组雾化吸入生理盐水。参考陈奇的实验方法^[2]，第8天上午给药后45 min，对照组尾iv生理盐水，其他各组尾iv 0.3%伊文思兰；同时所有动物ip 0.6%冰醋酸，15 min后脱颈椎处死小鼠，注入生理盐水冲洗腹腔，腹腔洗出液2 000 r/min离心10 min，取上清液于590 nm处测定吸光度（A）值，反映动物腹腔毛细血管通透性情况，以模型组腹腔洗出液A值显著升高判定毛细血管通透性亢进出现。

毛细血管通透抑制率＝（模型组腹腔灌洗液平均A值－给药组腹腔灌洗液平均A值）/模型组腹腔灌洗液平均A值

除阳性组换用地塞米松外，其余同2.1，同时加设对照组。参考陈奇的实验方法^[2]，第8天上午用游标卡尺测量各鼠右后足跖厚度，作为每鼠给药前足跖容积。小鼠右后足跖腱膜下注射1%角叉菜胶悬液，对照组相同部位注射生理盐水。致炎后每隔1小时测量右后足跖厚度，连续4次，计算足跖肿胀度和抑制率。

肿胀度＝致炎后右后足跖厚度－致炎前右后足跖厚度

抑制率＝（模型组足肿胀度－给药组足肿胀度）/模型组足肿胀度

角叉菜胶致炎4 h后，脱颈椎处死小鼠，剪取动物右后足相同部位，然后按照1∶9加入预冷的PBS溶液，匀浆后4 ℃下10 000×g离心15 min，收集上清液，严格按照试剂盒说明测定匀浆液中NO水平，采用ELISA法测定上清液中PGE2、IL-1β、TNF-α水平，采用BCA法测定上清液中总蛋白水平。

实验结果以x±s形式表示，以SPSS 13.0软件进行统计分析，采用t检验比较组间差异。

模型组小鼠右耳接触二甲苯后，出现明显肿胀，皮下渗出增加，致炎局部组织质量增加；清解方雾化吸入剂9.2、18.4 g/kg均能显著降低小鼠耳肿胀度（P＜0.05、0.01），见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 清解方对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（x ± s，n = 12） Table 1 Effect of Qingjie decoction on xylene induced ear edema in mice (x ± s,n = 12) 组别 剂量/(g·kg-1) 肿胀度/mg 抑制率/% 模型 — 2.667±1.483 — 布地奈德 0.005 0.708±0.403*** 73.438 清解方 4.6 3.100±1.336 -16.250 9.2 1.608±0.895* 39.688 18.4 1.117±0.877** 58.125 与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group

表 1 清解方对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（x ± s，n = 12） Table 1 Effect of Qingjie decoction on xylene induced ear edema in mice (x ± s,n = 12)

模型组小鼠腹腔灌洗液呈明显蓝色，在冰醋酸的刺激下，大量伊文思兰渗出至腹腔，灌洗液A值显著高于对照组。清解方雾化吸入剂9.2、18.4 g/kg均能降低灌洗液吸光度值（P＜0.05），对腹腔通透性的抑制率分别为25.06%、27.49%，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 清解方对冰醋酸致小鼠腹腔通透性亢进影响（x ± s，n = 12） Table 2 Effect of Qingjie Decoction on peritoneal hyper- vasopermeability stimulated by acetic acid in mice (x ± s,n = 12) 组别 剂量/(g·kg-1) 腹腔灌洗液A值 抑制率/% 对照 — 0.018±0.03 — 模型 — 0.451±0.17### — 布地奈德 0.005 0.241±0.16** 46.56 清解方 4.6 0.525±0.94 -16.41 9.2 0.338±0.08* 25.06 18.4 0.327±0.15* 27.49 与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01vs model group

表 2 清解方对冰醋酸致小鼠腹腔通透性亢进影响（x ± s，n = 12） Table 2 Effect of Qingjie Decoction on peritoneal hyper- vasopermeability stimulated by acetic acid in mice (x ± s,n = 12)

注射角叉菜胶后1～4 h内，小鼠足跖明显肿胀，厚度显著增加；清解方雾化吸入剂9.2、18.4 g/kg均能显著抑制角叉菜胶引起的足跖肿胀（P＜0.05），见表 3。清解方对足肿胀的抑制率结果见表 4，可见清解方对足肿胀的抑制率与剂量呈正相关。

表 3(Table 3)

表 3 清解方对角叉菜胶致炎后小鼠足跖厚度的影响（x ± s，n = 12） Table 3 Effect of Qingjie Decoction on plantar thickness after carrageenan injection in mice (x ± s,n = 12) 组别 剂量/(g·kg-1) 肿胀度/cm 致炎后1 h 致炎后2 h 致炎后3 h 致炎后4 h 模型 — 0.074±0.058 0.063±0.058 0.072±0.040 0.070±0.055 布地奈德 0.005 0.010±0.024** 0.007±0.042* 0.009±0.028*** 0.010±0.043** 清解方 4.6 0.032±0.027* 0.059±0.033 0.059±0.037 0.068±0.046 9.2 0.012±0.040** 0.023±0.044 0.032±0.042* 0.037±0.049 18.4 0.021±0.028** 0.018±0.027 0.047±0.038 0.016±0.031** 与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01***P＜0.001 *P＜ 0.05 **P＜0.01 ***P＜ 0.001 vs model group

表 3 清解方对角叉菜胶致炎后小鼠足跖厚度的影响（x ± s，n = 12） Table 3 Effect of Qingjie Decoction on plantar thickness after carrageenan injection in mice (x ± s,n = 12)

表 4(Table 4)

表 4 清解方对角叉菜胶致炎后小鼠足肿胀抑制率的影响（x ± s，n = 12） Table 4 Effect of Qingjie Decoction on inhibition rate of paw edema after carrageenan injection in mice (x ± s,n = 12) 组别 剂量/(g·kg-1) 抑制率/% 致炎后1 h 致炎后2 h 致炎后3 h 致炎后4 h 布地奈德 0.005 86.490 88.996 87.837 85.606 清解方 4.6 56.992 7.306 18.938 1.914 9.2 83.158 64.085 56.120 47.249 18.4 72.030 70.951 34.565 77.432

表 4 清解方对角叉菜胶致炎后小鼠足肿胀抑制率的影响（x ± s，n = 12） Table 4 Effect of Qingjie Decoction on inhibition rate of paw edema after carrageenan injection in mice (x ± s,n = 12)

注射角叉菜胶后，小鼠足跖组织内炎症介质NO、PGE2水平较对照组显著升高（P＜0.001）。清解方雾化吸入剂9.2、18.4 g/kg均能显著抑制炎症部位炎症介质NO、PGE2水平（P＜0.01、0.001），见表 5。

表 5(Table 5)

表 5 清解方对角叉菜胶致炎部位炎症介质的影响（x ± s，n = 12） Table 5 Effect of Qingjie Decoction on inflammatory mediator levels in inflammatory area (x ± s,n = 12) 组别 剂量/(g·kg-1) NO/(μmol·mg-1) PGE2/(pg·mg-1) 对照 — 5.77±0.62 32.94±5.41 模型 — 16.39±1.40### 195.77±22.33### 布地奈德 0.005 9.90±1.12*** 123.58±10.39*** 清解方 4.6 15.13±1.36* 186.71±19.31 9.2 14.71±1.39** 169.72±14.40** 18.4 10.87±1.04*** 162.04±16.85*** 与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 ###P ＜ 0.001 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group

表 5 清解方对角叉菜胶致炎部位炎症介质的影响（x ± s，n = 12） Table 5 Effect of Qingjie Decoction on inflammatory mediator levels in inflammatory area (x ± s,n = 12)

注射角叉菜胶引发小鼠足肿胀后，致炎因子IL-1β、TNF-α水平较对照组显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，清解方雾化吸入剂9.2、18.4 g/kg均显著抑制炎症部位细胞因子IL-1β、TNF-α的释放（P＜0.001），且清解方雾化吸入剂4.6 g/kg也显著抑制IL-1β的释放（P＜0.01），见表 6。

表 6(Table 6)

表 6 清解方对角叉菜胶致炎部位细胞因子的影响（x ± s，n = 12） Table 6 Effect of Qingjie Decoction on inflammatory cytokine concentrations in inflammatory area (x ± s,n = 12) 组别 剂量 TNF-α/(pg·mg -1) IL-1β/(ng·mg-1) 对照 — 11.33±0.95 69.74±7.62 模型 — 84.72±10.54### 140.87±12.59### 布地奈德 0.005 35.49±2.21*** 56.15±5.02*** 清解方 4.6 76.51±9.89 92.11±14.26*** 9.2 48.55±5.30*** 75.01±9.83*** 18.4 42.36±2.35*** 69.43±7.57*** 与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001 ###P ＜ 0.001 vs control group; ***P ＜ 0.001 vs model group

表 6 清解方对角叉菜胶致炎部位细胞因子的影响（x ± s，n = 12） Table 6 Effect of Qingjie Decoction on inflammatory cytokine concentrations in inflammatory area (x ± s,n = 12)

清解方作为广西中医药大学第一附属医院的临床验方，已有十余年的临床应用经验，对于各类以急性炎症反应为主要症状的感染性和非感染性炎症都有一定的疗效^[1]。近年来在儿科治疗中发现，该方对儿童慢性呼吸系统炎症也有很好的控制效果，但中药本身的苦味极大地限制了其在儿科临床应用，本研究以该方为基础制备的雾化吸入剂，避免了苦味的影响，临床应用范围进一步扩大。但雾化吸入剂的制备工艺不同于水煎剂，其药效特征可能改变。本课题组的研究已证明，清解方雾化吸入剂的急性毒性小于水煎剂，且没有明显的黏膜刺激性，其安全性较水煎液显著提高^[3]。

清解方的主要组成为岗梅根、千里光、一点红、桑叶，组方中的4味中药多为疏风清热、解毒利咽的药材，在已有的药理学研究中岗梅根、千里光、一点红都被认为有显著的抗炎活性。如范文昌等^[4]在对12种广东地产清热解毒药材的抗炎作用评价中发现，岗梅根水煎剂能明显抑制小鼠耳廓肿胀，并对小鼠毛细血管通透性增高具有显著的抑制作用。罗雅劲等^[5]发现，岗梅根醇提液可抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀、鸡蛋清致大鼠足跖肿胀炎症早期的水肿，减轻醋酸致小鼠毛细血管通透性增高实验中的渗出，可抑制大鼠棉球肉芽肿炎症晚期的组织增生和肉芽组织生成，表明岗梅醇提液具有显著的抗炎活性。千里光作为清热解毒类中药，有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及抗氧化等作用^[6]，并且其中的千里光总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸致小鼠毛细血管通透性的增加以及小鼠棉球肉芽肿的形成均具有明显的抑制作用，此外能显著减少小鼠气囊滑膜炎模型的炎症渗出液中白细胞数和PGE2含量^[7]，这与本研究中观察到的清解方雾化吸入剂减少足肿胀部位NO、PGE2生成的效果是相似的。一点红为广西民间常用壮药，有清热解毒、散瘀消肿的功效。钟正贤^[8]的研究也已经报道了一点红水提物和醇提物均有一定的抗炎、镇痛及免疫增强作用，对冰醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性亢进有显著的抑制效果。由上述4味清热解毒药材组成的清解方能疏风清热，解毒利咽，在临床应用上已经得到了证实。但是清解方的雾化吸入剂并不是通过简单的水煎而来，其安全性与水煎剂已有不同，而其抗炎作用也需要重新评价。本研究对清解方雾化吸入剂的抗炎作用进行了考察，在二甲苯致耳肿胀实验及角叉采胶致足肿胀实验中均发现，清解方雾化吸入剂对非感染性炎症肿胀有显著的抑制作用，提示雾化吸入的清解方毒性较水煎剂有所降低，但对急性炎症仍然有较明显的抗炎作用。

NO、PGE2为炎症急性期大量出现的炎症介质，介导了急性炎症反应的红肿热痛症状，抑制NO、PGE2的大量出现是很多药物抗炎作用机制之一^[9]。在机体收到抗原、内毒素、细菌及病毒等受各种刺激因子影响下，机体免疫系统激活，致炎细胞因子如IL-1β、TNF-α的大量出现，这是引起炎症反应的另一个重要环节，抗炎药物的重要作用机制之一就是通过减少IL-1β、TNF-α等生成，减轻炎症症状^[10]。本研究中雾化吸入清解方雾化吸入剂对肿胀组织中的NO、PGE2释放有显著的抑制，这些炎症介质的释放减少可能是IL-1β、TNF-α的释放量下降，炎症区域免疫系统稳定性增加的作用结果。

清解方雾化吸入剂是在清解方口服水煎剂的基础上进一步加工而成，在急性毒性降低，安全性有所增加的同时，雾化吸入清解方仍然能减轻急性炎症症状，在急性炎症动物模型中表现出较好的抗炎效果。其抗炎作用机制可能在于降低IL-1β、TNF-α致炎细胞因子的释放，从而减少炎症部位NO、PGE2炎症介质的生成，发挥控制急性炎症症状的作用。