三七总皂苷为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk) F.H.Chen的主根或根茎加工制成^[1]。目前以三七总皂苷为原料的制剂有口服剂和注射剂,其中三七总皂苷注射剂广泛用于卒中偏瘫、瘀血阻络、脑血管疾病后遗症和视网膜中央静脉阻塞等疾病的治疗^[2,3,4]。三七中含有二醇型皂苷三七皂苷K,该化合物具有显著的溶血活性,能够增强被卵白蛋白免疫的小鼠体内有丝分裂原诱导和卵白蛋白诱导的脾细胞扩增^[5]。为了快速、准确地测定三七总皂苷中三七皂苷K,本课题组制备了三七皂苷K对照品^[6]。本研究采用超高效液相色谱(UPLC)法对三七总皂苷中三七皂苷K进行了测定,为完善三七总皂苷及其注射剂质量控制研究以及提高三七总皂苷注射剂的安全性提供科学依据。

取三七药材粗粉,加乙醇提取,提取液滤过、浓缩,残留物加水溶解,滤过,滤液通过D₁₀₁型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再以60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,滤过,滤液浓缩至干,即得三七总皂苷,共10批。三七皂苷K对照品由昆药集团股份有限公司提供,质量分数为98.7%

Waters H-Class超高效液相色谱仪,5510E-DTH型超声波清洗器(美国必能信公司),XP205型分析天平(梅特勒-托利多公司)。乙腈为色谱纯(美国Fisher公司),甲醇为分析纯,水为注射用水。

Cosmosil Cholester色谱柱(50 mm×2.0 mm,2.5 μm);流动相:[水-乙腈(85:15)](A)-乙腈(B),进行梯度洗脱,见表1;体积流量0.5 mL/min;检测波长203 nm;柱温30℃;进样量2 μL。理论塔板数按三七皂苷K峰计算应不低于5 000。

表 1(Table 1)

表 1 三七皂苷K的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of notoginsenoside K t /min A/% B/% 0 94 6 10 94 6 17 83 17 25 60 40 30 94 6 35 94 6

表 1 三七皂苷K的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program of notoginsenoside K

精密称取三七皂苷K对照品适量,加甲醇溶解并稀释制成20 μg/mL的溶液,即得。

取三七总皂苷0.1 g,精密称定,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,即得。

精密称取三七皂苷K对照品10.1 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释到刻度,制成0.10 mg/mL储备液。分别精密量取储备液适量,配制成2.020、5.050、10.100、20.200、40.400、101.000 μg/mL溶液,进样,测定峰面积。以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归计算,得到线性方程Y=490.0 X-315.0,r=0.999 9。结果表明三七皂苷K在2.020~101.000 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

取批号2013011三七总皂苷样品,制备供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定三七皂苷K峰面积,结果其RSD值为0.15%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取10.1 μg/mL三七皂苷K对照品溶液,连续进样7次,测定三七皂苷K峰面积,结果其峰面积的RSD值为0.56%。

取批号2013011三七总皂苷样品,平行取样6份,制备供试品溶液,进样测定三七皂苷K的峰面积值,计算三七皂苷K的质量分数,结果其RSD值为1.58%。

精密称取批号2013011三七总皂苷样品0.1 g,共9份,分别加入三七皂苷K对照品0.84、1.05、1.26 mg,制备供试品溶液,进样测定三七皂苷K峰面积值,计算回收率,结果平均回收率为99.50%,RSD值为1.35%。

分别取10批三七总皂苷样品,各0.1 g,平行取样2份,制备供试品溶液,进样测定,以外标法计算三七皂苷K的质量分数,色谱图见图1,结果见表2。

图 1 三七皂苷K对照品（A）和三七总皂苷样品（B）的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of notoginsenoside K reference substance (A) and Notoginsengtotal saponins samples (B)

表 2(Table 2)

表 2 三七总皂苷样品中三七皂苷K的测定结果 Table 2 Determination of notoginsenoside K in Notoginseng total saponins 批 号 三七皂苷K/% 批 号 三七皂苷K/% 2013011 0.27 2014006 0.16 2013012 0.28 2014007 0.12 2013013 0.25 2014008 0.14 2013014 0.27 2014009 0.17 2013015 0.24 2014010 0.15

表 2 三七总皂苷样品中三七皂苷K的测定结果 Table 2 Determination of notoginsenoside K in Notoginseng total saponins

参考了三七总皂苷高效液相色谱测定方法,对流动相进行筛选,最终确定在乙腈-水系统中,本品保留时间适宜,峰形和分离度均达到要求。 本实验采用UPLC法测定了三七总皂苷中三七皂苷K,结果显示,建立的UPLC法操作简便、结果可靠、重复性好、专属性强,可用于三七总皂苷中三七皂苷K的质量控制。结合三七皂苷K具有显著的溶血活性,本实验为三七总皂苷及其注射剂的质量提升和安全性提升提供了科学依据。