现代药物与临床  2015, Vol. 30 Issue (4): 366-369
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.1674-5515.2015.04.004
高源, 邢亚超, 郭俐含, 李艳然, 倪慧, 卿德刚, 李宁. 新疆阿魏树脂不同极性部位对人肺癌细胞的体外抑制作用研究[J]. 现代药物与临床, 2015, 30(4): 366-369.
GAO Yuan, XING Ya-chao, GUO Li-han, LI Yan-ran, NI Hui, QING De-gang, LI Ning. Inhibition of different fractions from Ferula sinkiangensis resin on human lung cancer cells in vitro[J]. DRUGS&CLINIC, 2015, 30(4): 366-369.
新疆阿魏树脂不同极性部位对人肺癌细胞的体外抑制作用研究
高源1, 邢亚超1,2, 郭俐含1, 李艳然1, 倪慧3, 卿德刚3, 李宁1    
1. 沈阳药科大学 中药学院 基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室, 辽宁 沈阳 110016;
2. 扬子江药业集团上海海尼药业有限公司, 上海 201318;
3. 新疆维吾尔自治区中药民族药研究所, 新疆 乌鲁木齐 830002
收稿日期: 2015-03-01;
基金项目： 沈阳药科大学大学生创新创业计划项目
作者简介：高源(1992－),男,河北唐山人,沈阳药科大学中药学院食品药学研究方向学生.E-mail:373233293@qq.com邢亚超(1990－),女,山东聊城人,硕士研究生,主要从事天然药物化学研究.E-mail:xing.yachao@163.com
通讯作者：李宁(1979－),女,河北保定人,副教授,博士,主要从事天然药物化学研究.Tel:(024)23986475E-mail:liningsypharm@163.com
摘要：目的 研究新疆阿魏的提取物、不同极性部位以及倍半萜香豆素类化合物对人肺癌细胞的体外抑制作用,明确新疆阿魏树脂的活性成分.方法 应用MTT法检测新疆阿魏树脂提取物(100 mg/mL)、不同极性部位(100 mg/mL)和倍半萜香豆素化合物(100、50、10、1、0.1 μmol/L)对人肺癌细胞系A549、H292、H1792、H460作用48 h后生长的抑制作用,采用抑制率和IC50为指标衡量其活性.结果 新疆阿魏树脂氯仿提取物在100 mg/mL质量浓度下对A549、H292、H1792、H460细胞系的抑制率分别为75.45%、65.39%、46.54%、73.68.低极性部位在100 mg/mL质量浓度下对4种细胞系的生长抑制率分别为88.74%、80.62%、60.11%、92.35%.从低极性部位中分离得到的主要倍半萜香豆素类化合物farnesiferol B、farnesiferone A、farnesiferol C、多花素宁,其中farnesiferol C、多花素宁的IC50分别为35.49、15.44、44.25、21.63 μmol/L和23.60、17.90、38.33、12.35 μmol/L,表现出显著的生长抑制作用,且具有剂量相关性.结论 新疆阿魏树脂的低极性部位为体外抑制人肺癌细胞生长作用的活性部位,其所含有的高含量倍半萜香豆素化合物farnesiferol C为其主要活性成分.
关键词： 新疆阿魏树脂     人肺癌细胞     倍半萜香豆素     farnesiferol C     抑制作用    
Inhibition of different fractions from Ferula sinkiangensis resin on human lung cancer cells in vitro
GAO Yuan1, XING Ya-chao2,1, GUO Li-han1, LI Yan-ran1, NI Hui3, QING De-gang3, LI Ning1    
1. Key Laboratory of Structure-Based Drug Design & Discovery of Ministry of Education, School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China;
2. Shanghai Haini Pharmaceutical Co. Ltd., Yangtze River Pharmaceutical Group, Shanghai 201318, China;
3. Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China
Abstract: Objective To study inhibitory action in vitro on human lung cancer cells of extract, different fractions, and sesquiterpene coumarins from Ferula sinkiangensis resin, and to clarify its effective constituent. Methods Using MTT method, inhibitory actions of chloroform extract (at concentration of 100 mg/mL), different polarity fractions (at concentration of 100 mg/mL), and sesquiterpene coumarins (at different concentrations of 100, 50, 10, 1, and 0.1 μmol/L) from F. sinkiangensis resin were tested on A549, H292, H1792, and H460 cell lines after 48 h co-incubation. The inhibition rate and IC50 values were calculated to assay their effects. Results The chloroform extract from F. sinkiangensis resin exhibited significant inhibitory action at 100 mg/mL against A549, H292, H1792, and H460 human lung cancer cells with inhibition rates as 75.45%, 65.39%, 46.54%, and 73.68%, respectively. And the low polarity fraction had inhibitory action at 100 mg/mL against the four human lung cancer cells with inhibition rates as 88.74%, 80.62%, 60.11%, and 92.35%, respectively. Sesquiterpene coumarins farnesiferol B, farnesiferone A, farnesiferol C, and polyanthinin were isolated from low polarity fraction, and farnesiferol C and polyanthinin showed significant inhibitory action on growth of human lung cancer cells with dose dependent manner. The IC50 values of farnesiferol C were 35.49, 15.44, 44.25, and 21.63 Conclusion Low polarity fraction is considered as the effective part of F. sinkiangensis resin for inhibitory activities against human lung cancer cell lines, and the sesquiterpene coumarin farnesiferol C isolated from it is main active constituent.
Key words: Ferula sinkiangensis resin     human lung cancer cells     sesquiterpene coumarins     farnesiferol C     inhibitory action    

新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen属伞形科阿魏属植物，其药用部位根或茎的树脂收录于《中国药典》2010年版一部[1]。阿魏属植物中含多种化学成分，以倍半萜香豆素、倍半萜化合物以及多硫化合物为其化学特性，倍半萜化合物及其酯、内酯多具有生物活性[2]。近年来由于发现其中具有抗肿瘤物质而备受关注，如新疆阿魏树脂不同分离部位对结肠癌细胞HCT116具有抑制作用[3]，F. szowitsiana DC.中umbelliprenin具有诱导急性T细胞白血病细胞凋亡的作用[4]，又如意大利学者Poli等[5]发现大茴香F. communis L.和F. arrigonii Bocchieri中胡萝卜烷型倍半萜对人结肠癌细胞具有抗增殖作用。Huang等[6]从全裂叶阿魏F. dissecta (Ledeb.) Ledeb.根中分离得到两个新的倍半萜苯甲酸酯syreiteate A、B对人宫颈癌细胞具有抗增殖作用。为了阐明新疆阿魏树脂的抗肿瘤作用及其活性成分，本课题组采用人肺癌细胞系A549、H292、H1792、H460对新疆阿魏的提取物、不同极性部位以及化合物进行了体外抗肿瘤活性研究，以期为阿魏的进一步开发和利用提供依据。 1 材料与仪器

新疆阿魏为伞形科阿魏属新疆阿魏Ferula sinkiangensis K. M. Shen的根茎中得到的树脂，由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所提供，经新疆维吾尔自治区中药民族药研究贾晓光研究员鉴定。

胎牛血清（批号1339728）购自Gibco BRL，RPMI-1640培养基（批号307964）购于Gibco公司，四甲基偶氮唑盐（MTT，批号111108）购自美国Sigma公司。顺铂为上海旭东海普药业有限公司生产，二甲基亚砜（DMSO）由沈阳化学试剂厂生产。

薄层色谱及制备型薄层用硅胶GF254、柱色谱用硅胶（200～300目）均由青岛海洋化工厂生产，ODS（10～30 μm）为天津化学试剂二厂色谱技术开发公司产品；Sephadex LH-20为瑞士Pharmacia公司产品；柱色谱试剂规格均为分析纯，其中所用石油醚为中沸程（60～90 ℃）；HPLC用溶剂均为色谱纯。

CO2培养箱为美国Forma公司产品，V1.23全自动酶标分析仪为Multiskan Ascent产品，96孔细胞培养板由Costar公司生产，HPLC应用Shimadzu CTO-6A高效液相色谱仪。

人肺癌细胞系A549、H460、人黏液表皮样肺癌细胞系H292、人肺腺癌细胞系H1792均购自南京科佰生物科技有限公司，批号分别为CBP60084、CBP60138、CBP60187、CBP60166。 2 方法与结果 2.1 极性部位的制备

新疆阿魏树脂900 g用氯仿回流提取3次，2 h/次，浓缩得提取物浸膏558 g。取300 g浸膏经硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱。石油醚-丙酮（100∶0～100∶5）洗脱馏分为低极性部位（56.7 g），石油醚-丙酮（100∶6～10∶1）洗脱馏分为中等极性部位（67.5 g），石油醚-丙酮 （8∶1～10∶1）洗脱馏分为高极性部位（20 g）。 2.2 细胞培养

取对数生长期的细胞，以内含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释为5×103/L细胞悬浮液，接种于96孔板内，100 μL/孔，培养于37 ℃、5% CO2培养箱内。培养24 h后加药，作用48 h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设6个复孔。 2.3 添加试药

待测提取物和各极性部位样品以二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成质量浓度均为100 mg/L的母液，储存于−20 ℃。临用时提取物和各极性部位样品用相应的培养液稀释为100 mg/mL。待测化合物样品以DMSO溶解，配成质量浓度均为100 mmol/L的母液，储存于−20 ℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100、50、10、1、0.1 μmol/L。DMSO配制的样品进行实验时，DMSO的终浓度为0.1%。阳性药顺铂浓度分别为100、50、10、1、0.1 μmol/L。将上述含药培养液加入96孔板中，放置于与细胞培养相同条件的培养箱中培养48 h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设4个复孔。 2.4 MTT法检测

药物作用48 h后，将细胞与0.25 mg/mL MTT于37 ℃下共同孵育4 h，离心，小心吸除培养液后每孔加入100 μL DMSO，完全溶解后使用酶标仪于570 nm测定其吸光度（A）值。以空白组A值为细胞存活率100%，抑制率为0，计算各组细胞的抑制率。采用LOGIT法计算药物半数抑制浓度（IC50）。

抑制率=（1－A给药）/A空白

2.5 提取物及不同极性部位对人肺癌细胞的体外抑制作用

MTT法活性结果显示新疆阿魏氯仿提取物和不同极性部位对人肺癌细胞系A549、H292、H1792、H460的生长具有抑制作用。低极性成分和中等极性成分为主要活性部位，且低极性成分活性强于中等极性成分。根据阿魏中化学成分分布的特点，低极性部位中主要是含氧取代基团数目较少、环系结构较多的低极性倍半萜香豆素类化合物，提示这类成分可能为新疆阿魏树脂抗肿瘤活性的物质基础。见表 1。

表 1 新疆阿魏树脂氯仿提取物和不同极性部位对人肺癌细胞的抑制作用 Table 1 Inhibitory actions of extract and different polarity fractions from F. sinkiangensis resin against human lung cancer cells
2.6 化合物的制备

低极性部位共分为Fr.1～Fr.4。Fr.4经硅胶吸附柱色谱石油醚-醋酸乙酯（100∶0～1∶1）洗脱，其中石油醚-醋酸乙酯（10∶1）洗脱流份经重结晶、展开系统为石油醚-醋酸乙酯（8∶1）的制备薄层色谱得到化合物1（2.0 g，0.413%）；石油醚-醋酸乙酯（10∶8）洗脱流份经硅胶柱色谱石油醚-二氯甲烷（8∶1）重结晶得到化合物2（728.8 mg，0.151%）。Fr.3经硅胶吸附柱色谱环己烷-醋酸乙酯（100∶4～1∶1）洗脱，其中硅胶柱色谱环己烷-醋酸乙酯（100∶8）洗脱流份经重结晶得到化合物3（1.6 g，0.331%）；环己烷-醋酸乙酯（10∶1）洗脱流份经ODS柱色谱、HPLC色谱甲醇-水（78∶22）分离得化合物4（20.5 mg，0.004%）。利用波谱技术，综合对比文献，鉴定化合物1～4分别为farnesiferol B[7]、farnesiferone A、farnesiferol C、多花素宁（polyanthinin），均为倍半萜香豆素类化合物。 2.7 倍半萜香豆素类化合物对人肺癌细胞的体外抑制作用

对从新疆阿魏树脂活性部位中分离的倍半萜香豆素测试在100、50、10、1、0.1 μmol/L浓度下对人肺癌细胞系A549、H292、H1792、H460生长的抑制作用，计算IC50值，结果见表 2。可见farnesiferol C、多花素宁对A549、H292、H1792、H460细胞作用48 h后均表现出显著的生长抑制作用，且具有剂量相关性。farnesiferol C对H292的抑制活性以及多花素宁对A549、H292、H460的抑制活性均强于阳性药顺铂。farnesiferol B对A549、H292、H460细胞均表现出显著的生长抑制作用。farnesiferone A对H292细胞的生长具有显著的抑制活性。

表 2 新疆阿魏树脂中倍半萜香豆素对人肺癌细胞生长的抑制作用 Table 2 Inhibitory actions of sesquiterpene coumarins from F.sinkiangensis resinagainst human lung cancer cells
3 讨论

结合化合物的含量和活性结果分析，高含量farnesiferol C为新疆阿魏树脂主要活性成分之一。本研究系统探讨阿魏树脂不同活性部位的体外抗肺癌细胞生长的活性，并以此活性为导向分离得到了倍半萜香豆素类活性成分。在此基础之上，本研究组将进一步研究活性成分farnesiferol C的体内抗肿瘤作用，并阐明其作用机制，为从新疆阿魏中发现新的抗肿瘤药物奠定基础。

参考文献
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