知母为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根茎，具有清热泻火、生津润燥等功效^[1]，为我国传统的常用中药。盐知母是临床上常用的炮制品种，被历版《中国药典》所收载。传统理论认为知母盐炙后能够引药入肾经，增强滋阴降火的作用^[2]。知母中主要化学成分为皂苷类和双苯吡酮类。前期本课题组对知母盐炙前后皂苷类成分的量进行了比较，结果表明，盐炙使皂苷类成分的量发生变化，不同皂苷之间可能发生了转化^{[3, 4]}。本实验建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定知母中3种双苯吡酮类的方法，并比较知母盐炙前后3种成分的变化，为知母盐炙原理的深入解析提供参考依据。

Waters高效液相色谱仪（Waters e2695、Waters 2998 PDA、自动进样装置），KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FA10004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司），Mettler AE240型十万分之一分析天平（瑞士Mettler公司）。

新芒果苷（批号20131214）、异芒果苷（批号20121221）对照品购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%；芒果苷对照品（批号111607- 200402）购自中国食品药品检定研究院，质量分数≥98%。知母饮片（批号1204167）购于四川新荷花中药饮片股份有限公司（简称新荷花），知母药材采自河北省易县西陵镇太和庄、龙泉庄，经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根茎。乙腈为色谱纯（瑞典Oceanpak公司）、水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

盐知母按前期优选的工艺自行炮制^[5]，即知母饮片100 g加入30 mL盐水（含3 g食盐）拌匀润透，150～160 ℃炒制8 min。得率为99.12%。

Ecosil色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.2%冰醋酸（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～25 min，15%A），体积流量1.0 mL/min，检测波长258 nm，柱温室温，进样量10 μL。

精密称取新芒果苷、芒果苷、异芒果苷对照品适量，用甲醇溶解，配制成质量浓度分别为0.860 0 mg/mL、0.806 5 mg/mL、0.039 0 mg/mL的混合对照品溶液。

称取知母样品（过三号筛）约0.25 g，精密称定，置于250 mL具塞锥形瓶中，加稀乙醇约100 mL，称定质量，超声提取1 h（功率100 W，频率40 kHz），放冷后补足失去的质量，滤过，滤液蒸干，置10 mL量瓶中，用少许稀乙醇溶解，加稀乙醇至刻度，摇匀，即得。

精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL，分别注入HPLC仪，测定峰面积值。以峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，进行回归分析，得回归方程。新芒果苷：Y＝1.221×10⁹ X＋1.361×10⁶（r＝0.999 5）；芒果苷：Y＝3.774×10⁹ X＋5.313×10⁵（r＝0.999 7）；异芒果苷：Y＝4.016×10⁹ X－2.078×10⁴（r＝0.999 6），表明新芒果苷、芒果苷、异芒果苷分别在0.860 0～17.200 0 μg、0.806 5～16.130 0 μg、0.039 0～0.780 0 μg与峰面积的线性关系良好。

取混合对照品溶液，重复进样6次，测定新芒果苷、芒果苷、异芒果苷峰面积，计算得其RSD值分别为1.45%、1.67%、1.23%。

取新荷花生品样品，制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定。结果供试品溶液中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷峰面积的RSD值分别为1.37%、1.42%、1.39%。表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

取新荷花知母生品样品6份，制备供试品溶液，进样测定峰面积，计算质量分数，结果新芒果苷、芒果苷、异芒果苷质量分数的RSD值分别为1.29%、1.42%、1.56%。

取新荷花知母生品（含新芒果苷2.340%、芒果苷0.900%、异芒果苷0.067%）的知母样品粉末6份，每份约0.125 g，精密称定，分别加入0.990 2 mg/mL新芒果苷对照品溶液3 mL，0.556 4 mg/mL芒果苷对照品溶液2 mL，0.174 8 mg/mL异芒果苷对照品溶液50 μL，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的平均回收率分别为98.32%、98.30%、97.27%，RSD值分别为0.87%、0.74%、0.71%（n=6）。

取生知母、盐知母样品适量，制备供试品溶液，进样测定，采用外标法计算质量分数，色谱图见图 1，结果见表 1。

图 1 混合对照品（A>）和盐炙知母（B）>的HPLC图谱Fig. 1 Determination of neomangiferin, mangiferin, and isomangiferin in Anemarrhenae Rhizoma before and after processed with salt (n=3)

表 1(Table 1)

表 1 知母炮制前后新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的测定结果（n=3） Table 1 Determination of neomangiferin, mangiferin, and isomangiferin in Anemarrhenae Rhizoma before and after processed with salt (n=3) 样品 产地 质量分数/% 新芒果苷 芒果苷 异芒果苷 生品 龙泉庄 2.580 0.780 0.077 太和庄 2.720 0.710 0.074 新荷花 2.340 0.900 0.067 盐炙品 龙泉庄 1.910 0.860 0.061 太和庄 2.180 0.800 0.063 新荷花 1.450 1.230 0.057

表 1 知母炮制前后新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的测定结果（n=3） Table 1 Determination of neomangiferin, mangiferin, and isomangiferin in Anemarrhenae Rhizoma before and after processed with salt (n=3)

知母盐炙后，新芒果苷、异芒果苷的量降低，而芒果苷的量升高，因盐知母的得率为99.12%，质量变化微小，故新芒果苷、异芒果苷的量变化的原因不是由盐炙过程中失重造成的。推测可能在盐炙加热过程中，新芒果苷结构中的糖苷基（O-glc）发生断裂，转化成芒果苷（图 2），从而出现新芒果苷的量降低，而芒果苷的量升高。

图 2 新芒果苷转化为芒果苷的过程Fig. 2 Process of neomangiferin transformed into mangiferin

3 讨论

实验中分别考察了超声提取和回流提取，提取溶剂选用了稀乙醇、70%乙醇、50%甲醇、甲醇，提取溶剂的用量比较了50、100、150 mL，提取时间选取了0.5、1、2、3 h，根据实验结果及综合考虑操作简单、快速等方面，最终选用100 mL稀乙醇超声提取1 h的方法。实验中对这3种成分进行了全波长扫描，结果在258 nm下测定最佳。实验中分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%冰醋酸溶液等流动相系统，结果显示，乙腈-水，甲醇-水系统测定结果有拖尾现象，乙腈-0.2%冰醋酸溶液的分离、峰型都较好，故选用乙腈-0.2%冰醋酸溶液作为流动相。

芒果苷、芒果苷、异芒果苷均为知母中主要的双苯吡酮成分。本实验建立了HPLC法同时测定盐炙前后知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷的方法，通过考察知母中主要的双苯吡酮类成分盐炙前后的变化，为盐知母炮制原理的解析寻找实验依据。芒果苷具有抗炎解热、降血糖等功效^{[6, 7, 8]}，炮制后的量增加，是盐知母滋阴降火作用增强的物质基础之一，可为进一步研究盐知母炮制机制提供参考依据。