癌症是当前严重威胁人类健康的重要疾病之一，其治疗和预防长期以来也一直是人类所面临一大难题，也是医学界面临的一项挑战。近年来，科学家在分子水平上对肿瘤细胞内部的癌基因及抗癌基因的进行了深入的研究，使得针对肿瘤的特异性分子靶点设计新型药物成为当今抗肿瘤药物研发的主要方向。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导过程中发挥着重要的作用，所以针对这一靶点的药物已成为研发热点^{[1, 2]}。

凡德他尼（vandetanib、ZD6474）是已上市的小分子喹唑啉类靶向蛋白酪氨酸激酶抑制剂，对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）都具有显著的抑制作用^[3]。蛋白酪氨酸激酶与肿瘤的发生和发展有密切的关系，酪氨酸激酶的活性过高，导致其下游信号途径异常激活，从而导致细胞转化、增殖、对抗细胞凋亡、促进细胞生长，最终导致肿瘤的形成。临床试验结果表明凡德他尼对晚期非小细胞肺癌、乳腺癌等均具有很好的治疗效果^[4]。本课题组对凡德他尼的结构进行优化改造，合成出一系列的新型4-苯胺基喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂，并对这些化合物进行体外和体内的抗肿瘤活性研究，希望得到药理作用机制明确、治疗效果明显和安全性更好的候选化合物。

凡德他尼、TYIG1～TYIG9均由本实验室合成，结构式见图 1。以DMSO配制成0.1 mol/L的储备液，备用。

图 1

Fig. 1

图 1 凡德他尼和TYIG1～TYIG9的结构式 Fig. 1 Structures of ZD6474 and TYIG4 — TYIG9

EGFR、VEGFR-2激酶购自美国BPS Bioscience公司；Trisbase、ATP和HEPES购自美国Amresco公司；生物素标记的蛋白酪氨酸激酶多肽底物（poly-Glu-Ala-Tyr）、链激酶素标记的XL-665（一种经改良的别藻蓝蛋白）、结合生物素标记的抗磷酸化酪氨酸抗体的铕联穴状化合物（EuK）购自法国Cisbio Bioassay公司；DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；MTS检测试剂盒购自美国Promega公司。

人表皮鳞状细胞癌A431、人肺腺癌A549、人非小细胞肺癌H1975、人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自北京协和细胞资源中心，本实验室冻存使用；SPF级健康昆明种小鼠，体质量18～20 g，由军事医学科学院卫生环境医学研究所动物实验中心提供，许可证号SCXK（军）2009-0003。

根据均相时间分辨荧光（HTRF）法以EGFR、VEGFR-2为检测靶点对化合物进行筛选。

配制所需浓度的ATP、TK Substrate-biotin（TK-底物生物素）、Kinase buffer（激酶缓冲液）的工作液，ATP、TKSubstrate-biotin、Kinase buffer按体积比例2∶2∶2取液混匀；用Kinase buffer稀释药物配制为所需浓度；配制EGFR、VEGFR-2的酶工作液。在白色384孔板中，每孔加入6 μL混匀液，2 μL药物，2 μL激酶，混匀，置37 ℃温育反应30 min。然后加入5 μL链激酶素标记的XL-665及5 μL结合了Eu3+的穴状化合物抗体，混匀。室温放置30 min后于酶标仪314 nm激发，检测665、620 nm波长处的荧光，计算激酶抑制率^[5]。以抑制率为纵坐标，lg[M]为横坐标（M为浓度），采用Graphpad Prism 5.0软件拟合曲线，计算IC₅₀值。见表 1。

抑制率=（Ratio_{665/620对照孔}－Ratio_{665/620给药孔}）/Ratio_{665/620对照孔}×100%

表 1(Table 1)

表 1化合物对受试激酶抑制作用 Table 1 Inhibition of compounds on tyrosine kinase 化合物 IC50 /(nmol·L−1) VEGFR-2 EGFR 凡德他尼 41±0.12 ＞400 TYIG1 165±0.56 143±5.21 TYIG2 109±0.53 171±0.14 TYIG3 96±0.81 102±2.06 TYIG4 33±0.08 126±0.81 TYIG5 48±0.47 32±0.05 TYIG6 32±0.50 15±0.16 TYIG7 49±0.16 27±0.08 TYIG8 51±0.74 131±0.09 TYIG9 44±0.15 48±0.11

表 1化合物对受试激酶抑制作用 Table 1 Inhibition of compounds on tyrosine kinase

以EGFR和VEGFR-2为筛选靶标，凡德他尼作为阳性对照药，采用HTRF法对目标化合物进行活性初筛。根据初筛结果，测定IC₅₀值，结果TYIG4～TYIG9对VEGFR-2激酶抑制活性与凡德他尼相当，而TYIG1～TYIG9对EGFR激酶的抑制活性均高于凡德他尼。

运用该分析方法从TYIG1～TYIG9目标化合物中筛选出6个活性较好的化合物进行细胞层面的活性研究，其中化合物TYIG4、TYIG6对EGFR、VEGFR-2抑制作用均优于凡德他尼，表现了突出的酪氨酸激酶的抑制活性。

取含10%胎牛血清的培养基，37 ℃、5% CO₂条件下培养肿瘤细胞^[6]，2～3 d传代1次。取生长态势优良的细胞接种于96孔培养板内，接种的细胞浓度为1×10⁴/孔；待24 h细胞完全贴壁后，吸除原培养基，D-hanks缓冲液冲洗，加入无胎牛血清的培养基配制的TYIG4～TYIG9药物溶液，终浓度依次为0.3、1、3、10、30、100 μmol/L，对照组内加入0.1% DMSO，每组设3个复孔，并设对应的空白组。37 ℃、5% CO₂继续培养48 h，每孔加入20 μL MTS检测试液，培养箱中继续培养30 min。放入酶标仪中，于490 nm波长处读取各孔吸光度（A）值，计算抑制率。以抑制率为纵坐标，lg[M]为横坐标（M为浓度），采用Graphpad Prism 5.0软件拟合曲线，计算IC₅₀值。见表 2。

抑制率＝[1－（A_药物－A_空白）/（A_对照－A_空白）]×100%

表 2(Table 2)

表 2目标化合物对不同肿瘤细胞的IC50值 Table 2 IC50 values of target compounds on different tumor cells 化合物 IC50 /(μmol·L−1) A431 A549 H1975 MDA-MB-231 凡德他尼 0.85 4.37 4.81 21.29 TYIG4 0.99 6.09 9.03 — TYIG5 0.54 6.46 10.62 12.88 TYIG6 0.48 3.85 4.12 20.41 TYIG7 0.83 5.37 12.78 — TYIG8 1.05 8.16 10.07 10.04 TYIG9 0.91 10.20 15.39 9.35 — 表示其IC50值超出实验中最大给药浓度 — IC50 value beyond maximum concentration

表 2目标化合物对不同肿瘤细胞的IC50值 Table 2 IC50 values of target compounds on different tumor cells

根据HTRF法对目标化合物的筛选结果，挑选出对酪氨酸激酶抑制活性表现良好的TYIG4～TYIG9进行细胞活性评价。选用人表皮鳞状细胞癌A431细胞系（EGFR高表达）、人肺腺癌A549细胞系（EGFR正常表达）、人非小细胞肺腺癌H1975细胞系（EGFR正常表达）为主要的活性化合物靶点检测细胞；人乳腺癌MDA-MB-231细胞系（EGFR低表达）为对比评价细胞，采用MTS法检测目标化合物对4种肿瘤细胞增殖抑制率^[7]。结果表明，目标化合物中选用的3种EGFR表达的靶细胞（A431、A549、H1975）均有不同程度的细胞增殖抑制作用，其中TYIG4、TYIG7、TYIG8、TYIG9对该细胞的增殖抑制作用与凡德他尼相当，TYIG5、TYIG6对这3种细胞的增殖抑制作用强于凡德他尼，但只有TYIG6对非靶细胞（MDA-MB-231）生长影响很小，具有良好的靶向作用。

人H1975肺癌移植瘤裸鼠，无菌条件下取局部生长良好的肿瘤组织。然后将瘤组织与生理盐水按1∶20的体积比例混合匀浆，制备成1×10⁷ PBS细胞悬液（显微镜下观察），皮下种植于6周龄的裸鼠腹侧，每只约注射0.2 mL。待体积增长到100～150 mm³进行试验。按肿瘤体积＝长径×短径²×0.5计算肿瘤的体积。动物按肿瘤大小随机分组，即模型组、TYIG6（50、100 mg/kg）组、凡德他尼（50 mg/kg）组^{[8, 9]}。各给药组灌胃给药，1次/d，连续2周，模型组给予同体积溶媒。从第1天开始，每3天测定1次肿瘤体积，称定动物质量。计算相对肿瘤体积（RTV），根据RTV计算肿瘤增殖速率。

RTV＝V_t／V₀，V_t：每次测量时的肿瘤体积，V₀：开始给药时的肿瘤体积。

肿瘤增殖速率=给药组的RTV均值／对照组的RTV均值×100

疗效评价标准：肿瘤增殖速率＞60%为无效；肿瘤增殖速率≤60%并经统计学处理P＜0.05为有效。实验结果以表示，用SPSS 17.0统计软件处理，采用ANOVA法检验，P＜0.05为差别有统计学意义。结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 TYIG 6和凡德他尼对人肺癌细胞H1975裸鼠移植瘤的抑制作用 Table 3 Inhibition of TYIG 6 and ZD6474 on nude mice transplanted by human lung cancer H1975 cells 组别 剂量/(mg·kg−1) 个数 体质量/g RTV 肿瘤增殖速率/% d0 d15 d0 d15 模型 — 8 8 20.5 22.7 3.78±0.19 — TYIG6 50 8 8 20.2 21.9 1.61±0.40** 42.59 TYIG6 100 8 8 20.6 21.0 1.32±0.25** 34.92 凡德他尼 50 8 8 20.1 19.4 1.35±0.32** 35.71 d0：分笼给药时间；d15：给药后15 d；与模型组比较：**P＜0.01 d0-administration time of cage d15- administration after 15 d **P <0.01vs model group>

表 3 TYIG 6和凡德他尼对人肺癌细胞H1975裸鼠移植瘤的抑制作用 Table 3 Inhibition of TYIG 6 and ZD6474 on nude mice transplanted by human lung cancer H1975 cells

根据体外药效筛选结果，选取化合物TYIG6进行体内抗肿瘤作用，并与对照凡德他尼进行比较。结果显示，50、100mg/kg TYIG6和凡德他尼（50 mg/kg）均能抑制肺癌细胞H1975的生长，且呈剂量相关性，肿瘤增殖速率分别为42.59%、34.92%、35.71%。根据疗效评价标准，50、100 mg/kg TYIG6对裸鼠肺癌细胞H1975均有疗效；50 mg/kg凡德他尼对裸鼠肺癌细胞H1975有疗效，TYIG6疗效略低于凡德他尼。给药后凡德他尼组均出现死亡，体质量呈下降趋势。

实验建立HTRF分析方法用于EGFR、VEGFR-2激酶抑制剂的体外筛选。结果凡德他尼对VEGFR-2激酶活性抑制的IC₅₀为41 nmol/L，与文献报道的IC₅₀相当^[10]。该方法结果可靠、数据稳定，且操作简便可用于酪氨酸激酶磷酸化抑制剂的高通量筛选。

在目标化合物的体外细胞活性筛选实验中，实验采用了MTS法。此方法是建立在MTT法的基础上，但在储存、敏感度、特异性等方面优于MTT法。

人肺癌H1975裸鼠模型对TYIG6进行体内抗肿瘤活性评价结果显示TYIG6不同剂量对肺癌H1975均具有很好的疗效，与凡德他尼相当。因H1975是EGFR-T790M突变的细胞，所以还需要进一步试验数据的支持。

综上所述，TYIG6体内外抗肿瘤活性良好，具有成为小分子靶向抗肿瘤药物的潜力，但还需要进一步作用机制研究，并为进一步的化合物结构修饰、改造和药理学研究提供参考数据^[11]。