知母为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有清热泻火、滋阴润燥的功效，临床常用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热等症^[1]。主产于河北，传统认为河北易县西陵一带所产品质最佳，称之为西陵知母。历版《中国药典》收载知母的品种均为生知母、盐知母。知母皂苷是知母中的活性成分，知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元分别是《中国药典》2010、2005年版知母测定的指标性成分，因属甾体皂苷，无紫外吸收，故均采用蒸发光散射检测器（ELSD）。ELSD的特点是散射光的对数响应值与组分的质量的对数呈线性关系，但此对数关系变异性较大，且其灵敏度较低，最低检测限在50～100 ng。电雾式检测器（charged aerosol detection，CAD）与ELSD比较，具有更高的灵敏度，对无紫外吸收化合物的检测，其最低检测限达到了1 ng^[2]，更适用于含有较弱或无紫外吸收的皂苷类成分分析。本实验采用HPLC-CAD法测定不同产地的知母和盐知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元，并比较知母盐炙前后变化，为知母饮片的质量控制提供实验依据。

LC—20AB型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配置自动进样器、PDA检测器；Corona电雾式检测器（美国ESA公司）；KQ—250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；Mettler AE240型十万分之一分析天平（瑞士Mettler）；FA1004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

知母皂苷BⅡ对照品（质量分数≥98%，批号Z08-110523）购自江西本草天工科技责任有限公司；菝葜皂苷元对照品（质量分数≥98%，批号110744-200509）购自中国食品药品检定研究院。8个不同产地知母药材见表 1，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的干燥根茎。甲醇、乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

表 1(Table 1)

表 1 不同产地的知母药材样品 Table 1 Samples of Anemarrhenae Rhizoma from different habitats 编号 产 地 备注 1 河北省易县大华龙乡 采于2013年3月 2 河北省易县西陵太和庄 采于2013年10月 3 河北省易县西陵龙泉庄 采于2013年10月 4 河北省易县西陵龙泉庄 采于2013年10月 5 山西省 散货，购于2010年9月 6 四川省 购自四川新荷花中药饮片有限公司（批号1204167） 7 安徽省亳州市 散货，购于2010年9月 8 内蒙古 散货，购于2010年9月

表 1 不同产地的知母药材样品 Table 1 Samples of Anemarrhenae Rhizoma from different habitats

按前期优选的炮制工艺自行炮制^[3]。100 g知母饮片加入30 mL盐水（含3 g食盐）拌匀润透，在150～160 ℃炒制8 min，得盐知母，收率为98%。

Thermo C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（25∶75）为流动相，体积流量为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30℃；Corona参数：氮气压力为241.3 kPa，Filter：High，Range：200 pA。

取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，加入30%丙酮制成4.88 mg/mL对照品溶液，备用。

取样品粉末0.5 g（过4号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%丙酮25 mL，称定质量，超声处理（功率400 W，频率40 Hz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用30%丙酮补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

精密吸取4.88 mg/mL知母皂苷BⅡ对照品溶液，用30%丙酮逐级稀释成30.5、61、122、244、488 μg/mL溶液，进样分析，测定色谱峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得回归方程Y＝145 105 X＋459 248，r＝0.999 4。结果表明，知母皂苷BⅡ在0.305～4.880 μg与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取4.88 mg/mL知母皂苷BⅡ对照品溶液，连续进样6次，测定知母皂苷BⅡ峰面积，计算得其RSD值为0.5%。

取生知母（样品1）供试品溶液，每次进样10 μL，分别在0、1、2、4、6、8、10 h进样分析，测定知母皂苷BⅡ色谱峰面积，计算得其RSD值为1.45%。结果表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

取生知母（样品1）6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定知母皂苷BⅡ色谱峰面积，计算知母皂苷BⅡ质量分数的RSD值为1.2%。

取生知母粉末（样品1）0.25 g，平行6份，精密称定，分别精密加入0.455 mg/mL知母皂苷BⅡ对照品溶液20 mL，制备供试品溶液，进样分析，测定知母皂苷BⅡ峰面积，计算回收率，结果平均回收率为99.1%，RSD值为1.2%。

取不同产地的生、盐知母样品，分别制备供试品溶液，进样测定，外标法计算生、盐知母中知母皂苷BⅡ的质量分数，结果见表 2，色谱图见图 1。

表 2(Table 2)

表 2 不同产地生、盐知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的测定结果（n=2） Table 2 alloys powder classification by size 编号 知母皂苷BⅡ/% 菝葜皂苷元/% 生知母 盐知母 生知母 盐知母 1 3.71 5.32 1.14 1.36 2 4.20 5.83 1.21 1.39 3 5.75 7.11 1.34 1.52 4 5.92 7.20 1.39 1.54 5 3.34 4.92 0.43 0.61 6 3.16 4.15 0.44 0.58 7 3.22 4.56 0.42 0.52 8 3.21 4.34 0.46 0.57

表 2 不同产地生、盐知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的测定结果（n=2） Table 2 Determination of tmosaponin BⅡ and sarsasapogenin in Anemarrhenae Rhizoma and Anemarrhenae Rhizoma processed with salt-water from different habitats (n=2)

1-知母皂苷BⅡ 1- timosaponin BⅡ图 1 知母皂苷BⅡ对照品（A）、生知母（B）和盐知母（C）的HPLC-CAD色谱图Fig. 1 HPLC-CAD chromatograms of timosaponin BⅡreference substance (A),Anemarrhenae Rhizoma sample(B),and Anemarrhenae Rhizoma processing with salt-water sample (C)

Diamonsil C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇-水（95∶5）为流动相，体积流量为1 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30℃；Corona参数：氮气压力为241.3 kPa，Filter：High，Range：200 pA。

精密称取菝葜皂苷元对照品适量，加甲醇制成3.92 mg/mL对照品溶液，备用。

取样品粉末（过三号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定质量，浸泡过夜，超声处理（功率200 W，频率30 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，加水10 mL，盐酸1 mL，加热回流2 h，取出，冷至室温，边振摇边滴加40%氢氧化钠溶液至溶液颜色由橙黄突变为橙红，用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

精密吸取菝葜皂苷元对照品溶液，逐级用甲醇稀释成24.5、49、98、196、392 μg/mL溶液，进样分析，测定色谱峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，得回归方程Y＝1 994 152.3 X＋17 035.6，r＝ 0.999 1。结果表明，菝葜皂苷元在0.490～7.840 μg与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取3.92 mg/mL菝葜皂苷元对照品溶液，按照上述色谱条件，连续进样6次，测定菝葜皂苷元峰面积，计算得其RSD值为0.79%。

取生知母（样品1）供试品溶液，每次进样10 μL，分别在0、1、2、4、6、8、10 h进样分析，测定菝葜皂苷元色谱峰面积，计算得其RSD值为1.3%。结果表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

取生知母（样品1）6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算菝葜皂苷元质量分数的RSD值为1.2%。

取生知母粉末（样品1）0.25 g，平行6份，精密称定，分别精密加入0.350 mg/mL菝葜皂苷元对照品溶液8 mL，制备供试品溶液并测定，计算回收率，结果平均回收率为98.0%，RSD值为1.3%。

取不同产地的生、盐知母样品，分别制备供试品溶液，进样测定，外标法计算生、盐知母中菝葜皂苷元的质量分数，结果见表 2，色谱图见图 2。

1-菝葜皂苷元 1-sarsasapogenin 图 2 菝葜皂苷元对照品（A）、生知母（B）和盐知母（C）的HPLC-CAD色谱图Fig. 2 HPLC-CAD chromatograms of sarsasapogenin reference substance (A),Anemarrhenae Rhizoma sample (B),and Anemarrhenae Rhizoma processing with salt-water sample (C)

可见不同产地知母药材中知母皂苷BⅡ质量分数为3.16%～5.92%，盐制后质量分数为4.15%～7.20%；菝葜皂苷元质量分数为0.42%～1.39%，盐制后质量分数为0.52%～1.54%。表明盐制后知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元质量分数均有所升高。

结果表明，河北易县一带产知母，即“西陵知母”中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的量明显高于山西、四川、安徽和内蒙等产地，可见知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的量与知母药材的道地性呈现正相关。

电雾式检测器作为一种新型通用检测器，其检测信号不依赖于被检测物质的化学结构，对不同结构的化合物有统一的响应^[4]，已经用于皂苷类、糖、脂质和多肽等样品的检测^{[5, 6, 7, 8, 9, 10]}。文献报道^[5]，通过对皂苷类成分的检测分析，与紫外和蒸发光散射检测器相比，电雾式检测器更加灵敏、准确和稳定。本实验建立HPLC-CAD法测定知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元，为知母及其他含有较弱或无紫外吸收成分药材的质量控制和分析研究提供参考。实验结果表明，得到的知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元标准曲线，CAD检测器的响应值与组分的质量呈线性关系，不同于蒸发光散射检测器响应值与组分质量的对数关系，且更便于计算。

知母皂苷BⅡ是《中国药典》2010年版规定的指标性成分，具有抗抑郁^[11]、保护神经细胞损伤作用^[12]，其快速制备方法已有报道^[13]。知母中所含甾体皂苷水解后的苷元主要是菝葜皂苷元，能间接反映总皂苷的量。因此，测定知母中这2种皂苷更能反映药材的真实质量状况。知母盐制后这2种皂苷量均增加，可能为盐知母滋阴降火作用增强的物质基础之一。推测知母在炮制过程中受辅料和加热等因素影响，其他皂苷发生水解，转化成知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元，具体的转化机制还需进一步研究。