中草药  2017, Vol. 48 Issue (5): 913-917
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.05.012
李艺丹, 张婷婷, 熊瑞, 郑凯旋, 赵永峰, 陈达, 孙继林, 胡昌江. 正交设计联用星点设计-效应面法优化雪胆炮制工艺[J]. 中草药, 2017, 48(5): 913-917.
LI Yi-dan, ZHANG Ting-ting, XIONG Rui, ZHENG Kai-xuan, ZHAO Yong-feng, CHEN Da, SUN Ji-lin, HU Chang-jiang. Optimization of processing technology of Hemsleya omeiensis by orthogonal design and central-composite design-response surface methodology[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, 48(5): 913-917 .
正交设计联用星点设计-效应面法优化雪胆炮制工艺
李艺丹1, 张婷婷1, 熊瑞1, 郑凯旋1, 赵永峰1, 陈达1, 孙继林2, 胡昌江1     
1. 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137;
2. 四川辅正药业股份有限公司, 四川 成都 611730
收稿日期: 2016-11-01
基金项目: 四川省2015年第一批科技计划项目“四川道地药材--雪胆创新炮制工艺技术标准与技术规范及质量标准”（2015SZ0107）
作者简介: 李艺丹 (1991-), 女, 在读硕士, 从事中药炮制学和中药新制剂新技术研究。Tel:15184479335, E-mail:1013183878@qq.com
通信作者: 胡昌江 (1952-), 男, 教授, 博士生导师, 从事中药炮制原理与质量标准研究。E-mail:hhccjj@hotmail.com
摘要: 目的 优化甘草制雪胆的炮制工艺。 方法 HPLC法测定雪胆素甲；以雪胆素甲质量分数为指标，采用正交试验考察闷润时间、烘干温度、烘干时间对甘草制雪胆炮制工艺的影响；进一步采用星点设计-效应面法（CCD-RSM）考察闷润时间和烘干时间对该炮制工艺的影响。 结果 正交试验确定的甘草制雪胆最佳炮制工艺为闷润7 h，80℃烘干12 h；CCD-RSM确定最佳炮制工艺为闷润时间7.48~8.56 h，烘干时间12.06~13.12 h。 结论 本实验首次使用甘草汁炮制雪胆，实验方法设计精确，模型、数据可靠，建立并优化了甘草制雪胆的炮制工艺。
关键词: 雪胆     甘草     星点设计-效应面法     正交设计     雪胆素甲     炮制工艺    
Optimization of processing technology of Hemsleya omeiensis by orthogonal design and central-composite design-response surface methodology
LI Yi-dan1, ZHANG Ting-ting1, XIONG Rui1, ZHENG Kai-xuan1, ZHAO Yong-feng1, CHEN Da1, SUN Ji-lin2, HU Chang-jiang1     
1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China;
2. Sichuan Fuzheng Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 611730, China
Abstract: Objective To optimize the processing technology of Hemsleya omeiensis processed by licorice juice. Methods HPLC was employed to determine the content of hemslecin A.Taking content of hemslecin A as index, the orthogonal test was adopted to optimize the covered moistening time, drying-time, and processing temperature. And the central composite design-response surface methodology (CCD-RSM) was adapted to optimize moistening time and drying-time further. Results The optimum processing technology of H. omeiensis by the orthogonal test was covered moistening time of 7 h, drying-time of 12 h, and processing temperature at 80℃. The optimum processing technology by CCD-RSM was covered moistening time of 7.48-8.56 h, drying-time of 12.06-13.12 h, and processing temperature at 80℃. Conclusion The experimental design method is precise and the data are reliable with the model. It is the first time that H. omeiensis is processed with licorice juice. Besides, it establishes the processing technology of H. omeiensis and provides a theoretical basis for the processing technology of H. omeiensis with licorice juice.
Key words: Hemsleya omeiensis L. T. Shen et W. J. Chang.     Glycyrrhiza uralensis Fisch.     central composite design-response surface methodology (CCD-RSM)     orthogonal design     hemslecin A     processing technology    

雪胆为葫芦科雪胆属植物长果雪胆Hemsleya dolichocarpa W. J. Chang、峨眉雪胆Hemsleya omeiensis L. T. Shen et W. J. Chang或巨花雪胆Hemsleya gigantha W. J. Chang的干燥块根，别名金龟莲、金盆、罗锅底，在《草木便方》《修订增补天宝本草》中均有记载；本品味苦，性寒，有小毒，具有清热解毒、利湿消肿、止痛止血的功效[1]。现代研究表明雪胆除了有抗炎、抗菌、抗病毒作用外，还具有良好的保肝、抗癌、抗动脉粥样硬化等作用[2-7]。雪胆在临床上应用广泛，具有疗效显著、服用剂量小、无耐药性等特点，被称为“天然抗生素”。但雪胆味苦，临床上顺应性较差尤其不能被儿童患者所接受。甘草汁作为一种常用的炮制辅料，具有清热解毒、矫味、调和诸药、缓解药物毒性作用。故本实验首次用甘草汁炮制雪胆，以期达到矫味、解毒、增效的效果。雪胆主要含雪胆素甲及少量雪胆素乙和皂苷成分，其中雪胆素甲和雪胆素乙为其主要有效成分[8-9]。故本实验以雪胆中雪胆素甲为炮制工艺的评价指标，设计采用正交设计和星点设计-效应面法（CCD-RSM）[10-11]联合运用对雪胆炮制工艺进行研究。

1 仪器与材料

仪器Agilent 1200高效液相色谱仪，包括DAD检测器，美国Agilent公司；SartoriusBS110S十万分之一分析天平，德国赛多利斯公司；UPH-I-10T优普系列超纯水器，成都超纯科技有限公司；KQ-300E超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

雪胆素甲对照品，批号111518-201103，质量分数99.6%，购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。药材均购于成都荷花池市场，经成都中医药大学药学院生药教研室卢先明教授鉴定，雪胆为葫芦科雪胆属植物峨眉雪胆Hemsleya omeiensis L. T. Shen et W. J. Chang的干燥块根，甘草为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根。

2 方法与结果 2.1 雪胆素甲定量分析方法的建立 2.1.1 色谱条件

采用HPLC标准曲线法定量，色谱柱为Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（35:65）；DAD检测器，检测波长为210 nm；柱温度为30 ℃；体积流量为1.0 mL/min；进样体积为10 μL。色谱图见图 1。

图 1 雪胆素甲对照品 (A) 和制雪胆 (B) 的HPLC图谱 Fig.1 HPLC of hemslecin A reference substance (A) and processed product (B)

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称定雪胆素甲对照品适量，甲醇定容，制成1.484 mg/mL的雪胆素甲对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取制雪胆（过2号筛）粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μL微孔滤膜滤过，取其续滤液作为供试品溶液，备用。

2.1.4 线性关系考察

取“2.1.2”项对照品溶液，分别配制成质量浓度为148.4、296.8、593.6、890.4、1 187.2、1 484.0 μg/mL系列对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下分别进样10 μL，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准工作曲线，线性方程为Y=504.86 X-535 805，R2=0.999 4（n=6）。结果表明，雪胆素甲在148.4~1 484.0 μg/mL线性关系良好。

2.1.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录雪胆素甲峰面积。雪胆素甲峰面积RSD为1.66%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取“2.1.3”项下供试品溶液，分别于0、6、8、12 h进样10 μL，测定并记录雪胆素甲的峰面积。雪胆素甲峰面积RSD为1.10%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.7 重复性试验

取同一批制雪胆6份，各约1 g，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液分别进样10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定并记录雪胆素甲的峰面积，计算得其质量分数的RSD为2.09%，表明该方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知雪胆素甲质量分数的制雪胆共6份，精密称定，分别精密加入适量的雪胆素甲对照品，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样分析，计算雪胆素甲的回收率，平均回收率为95.61%，RSD为2.18%。

2.2 辅料甘草与雪胆质量比的确定 2.2.1 辅料甘草汁的提取方法

取甘草40 g，加10倍量水浸泡1 h，煎煮2次，每次30 min，合并煎液，浓缩至所需浓度[12]。

2.2.2 甘草与雪胆质量比的确定

通过预试验对雪胆的吸水率考察，确定0.8倍量体积的甘草汁闷润雪胆。通过经典口尝法[13]考察不同质量浓度（0.125、0.250、0.375、0.500、0.625 g/mL）的甘草汁对雪胆苦味降低的影响，确定甘草与雪胆质量比为2:5，即用0.8倍量体积的生药量0.5 g/mL的甘草汁来炮制雪胆。

2.3 正交设计优选炮制工艺

取雪胆饮片，加入适量“2.2.1”项下甘草汁拌匀，进行闷润，润透后，烘干，取出，晾干，即得。

在预试验的基础上，以雪胆素甲为指标，选择闷润时间（A）、烘干温度（B）、烘干时间（C）为考察因素，采用L9(34) 正交表进行试验设计，因素水平、试验安排及结果见表 1，方差分析见表 2。

表 1 正交设计与结果 Table 1 Design and results of orthogonal test

表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance

由表 1中直观分析结果显示，各因素对试验结果影响程度为B＞C＞A；方差分析结果表明，各因素对试验结果影响均不显著，以A2B3C3组合为佳，即闷润8 h，80 ℃烘干，烘干12 h。按该工艺进行3次验证试验，结果雪胆素甲量分别为7.54、7.52、7.59 mg/g，平均质量分数为7.55 mg/g，表明优选的提取工艺稳定可行。

2.4 CCD-RSM优化炮制工艺

雪胆中含大量的葫芦素烷型四环三萜皂苷，而四环三萜皂苷类成分具有显著的抗炎、抗肿瘤、保肝、免疫调节等生物学活性，是雪胆发挥其疗效的物质基础[14-15]。有研究发现高温可能会降低皂苷类成分的量[16-17]，所以本实验未继续考察烘干温度而是固定烘干温度为80 ℃，采用CCD-RSM进一步优化炮制工艺。

2.4.1 因素水平编码

根据正交试验研究基础，采用CCD-RSM进一步优化炮制工艺，主要考察闷润时间（X1）和烘干时间（X2）2个因素，固定烘干温度为80 ℃。根据效应面法设计原理，参考正交试验的水平和结果，每个因素设5个水平，用代码、-1、0、1、等来表示，因素水平与编码见表 3。

表 3 CCD-RSM试验设计及结果 Table 3 Design and observed values for CCD-RSM

2.4.2 模型建立及显著性检验

将所得数据利用Design-Expert 8.0.6软件，以雪胆素甲质量分数为效应值（Y），利用最小2阶乘法对各因素（自变量）进行多元线性回归和2项式方程拟合，对比各模型拟合参数（表 4），结果表明2次多项式回归模型较优。以ANOVA分析效应面回归参数，建立Y对自变量X1、X2的2次方程为Y=0.442 79+1.256 89 X1+0.320 99 X2+0.057 870X1X2-0.122 39X12-0.030 093 X22（R2=0.932 3，S/N=11.899＞S/N临界=4）。

表 4 多种模型拟合分析 Table 4 Sequential model sum of squares for CCD

2.4.3 方差分析和显著性检验

经检验本实验模型具有统计学意义（P＜0.05），失拟（P＞0.05）不显著，说明本实验模型拟合程度良好，实验误差小，可以使用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析评价（表 5）。本模型响应面分析见图 2。

表 5 2次多项式方程模型方差分析 Table 5 ANOVA for response surface reduced quadratic model

图 2 雪胆素甲对X1、X2的立体分析图及等高线图 Fig.2 3D suface map and contour map of hemslecin A to X1 and X2

2.4.4 最佳工艺条件的预测与检验结果

通过回归模型的预测，最佳工艺范围X1：7.48~8.56 h，X2：12.06~13.12 h。结合前期基础研究与实际操作的方便性，得到甘草制雪胆的最佳炮制工艺为闷润时间为7.5 h，烘干温度为80 ℃，烘干时间为12 h，预测响应值为7.71 mg/g。为检测可靠性，采用上述的最优条件进行3次验证实验，结果雪胆素甲量分别为7.74、7.68、7.63 mg/g，在此条件下得到的响应值平均为7.68 mg/g，与理论值相差0.03 mg/g。

3 讨论

正交设计试验是中药研究常用优选方法，但其采用线性模型进行分析，结果代表的是各因素点水平效应，难以全面预测各因素水平间的效应变化，存在一定局限。响应面优化法采用多元线性和二次项模型拟合，分析各因素水平对应的响应值变化，预测优化各因素水平的趋势，优化工艺参数，更好优选工艺条件，提高中药产品质量[18-19]。在本实验中，先利用了正交简便的优点初步确定了雪胆的炮制工艺，然后在其基础上利用星点设计的非线性模型优点对其炮制工艺进一步优化，两种实验设计所优化的炮制工艺条件基本相似，但在正交基础上的星点效应面法进一步优化了雪胆的炮制工艺。

雪胆富含雪胆素，在临床上具有极高的药用价值。当前有研究发现，雪胆有良好的抗炎、镇痛、抗癌、保肝等作用。但关于其炮制工艺的研究尚未见报道。本实验通过正交试验联合星点设计-效应面法优化甘草制雪胆的炮制工艺。本实验首次使用甘草汁炮制雪胆，利用甘草味甘，清热解毒的特点来炮制雪胆，以期达到矫味、解毒、增效的目的。甘草作为辅料炮制药物的减毒增效多有研究[20-21]，现代研究认为甘草的减毒物质基础为甘草甜素及其水解后的甘草次酸和葡萄糖醛酸，其中甘草酸是甘草甜味的有效成分[22-23]。本实验利用辅料甘草的矫味功能，结合甘草和雪胆相同的清热解毒的功效，运用正交-星点设计效应面法优选出雪胆的最佳炮制工艺，为本课题相关质量标准研究、药理研究等做了前期的铺垫，制定的工艺适合大生产。

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