2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.04.017 |
血小板是恶性肿瘤发生血行转移的关键，一方面肿瘤细胞通过启动凝血系统，激活血小板，使得血浆中纤维蛋白原和血管性血友病因子（VWF）等重要黏附配体的水平上升，是血小板和癌细胞相互作用的重要桥梁[1]；另一方面，活化的血小板通过释放P-选择素（P-selectin）等生物活性刺激因子结合肿瘤细胞表面糖蛋白，介导侵袭转移信号级联反应，进一步促进肿瘤细胞的侵袭、浸润与转移[2]。因此，抑制血小板以及血小板来源的细胞因子对肿瘤细胞的影响可以有效地抑制肿瘤转移。
肿瘤疾病发生时，凝血酶、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）及脂多糖（LPS）等激活血小板后，胞内Weible-palade小体膜与胞膜迅速融合，可通过细胞排粒作用，在数秒内由胞内颗粒易位至内皮细胞及血小板表面[3]。黏蛋白是表达于大多数肿瘤细胞上的P-选择素配体，为二硫键连接而成的同源二聚体形式的唾液黏蛋白。P-选择素主要与肿瘤细胞表面的黏蛋白-1（Mucin-1）结合后向内信号传导活化磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶（PI3K/AKT）通路，上调整合蛋白超家族（intergrin supper family，Intergrins）的表达[4]。Intergrins高表达后经Paxillin-FAK-Src通路上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，促进肿瘤细胞的迁移、黏附能力[5]。
相当多的研究已在探讨以P-选择素为靶点的抗肿瘤转移疗法的可能性[6]。方向之一就是抑制P-选择素与其配体的相互作用，首先是抑制选择素配体在肿瘤细胞的表达，其次是使用选择素配体的类似物，再次是使用选择素配体的模拟物[7]。近年来，一些P-选择素的拮抗剂如岩藻糖（fucose）、O型唾液酸（O-sialic acid）、P-选择素糖蛋白配体1（P- selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）等已被开发，但由于这些P-选择素的拮抗剂存在不同的缺陷，比如交叉反应性能差、弱亲合力相对较低的选择、半衰期短等，这些不足之处大大限制了上述P-选择素拮抗剂的临床应用[8]。
橙皮素（hesperetin）是柑桔属植物中普遍存在的一种类黄酮物质，具有抗氧化、抗炎、抗变态性反应、调血脂、保护心血管和抗肿瘤的药效作用。近年来，体内、外研究证实，橙皮素具有抑制甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞生长，诱导凋亡效应[9-10]，但具体机制尚不明确。本研究证实橙皮素通过竞争性拮抗P-选择素与Mucin-1相结合，阻断P-选择素活化的Intergrin-MMPs蛋白信号通路来影响肿瘤细胞的迁移黏附。在体外实验中选用MDA-MB-231人乳腺癌细胞考察橙皮素对P-选择素介导的细胞迁移以及黏附关键环节的影响。进一步采用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫印迹（Western blotting）等方法对橙皮素抗肿瘤作用机制进行深入研究，以期阐明橙皮素发挥抗肿瘤转移的确切分子机制，为临床上开发安全、有效的抗肿瘤候选药物提供实验依据。
1 材料 1.1 试剂与药品橙皮素，上海源叶生物有限公司，批号B20184，质量分数99%；人血小板（购于江苏省血液中心），仅供本研究使用。DMEM（美国Gibco公司，批号758137）；胎牛血清（Hyclone公司，批号KPF21390）；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTS，Promega公司，批号30502301）；P-选择素（Prospec公司，批号610PSEL07）；各种抗体如下：PI3K/AKT/Paxillin/FAK/Src购自SAB公司，Mucin-1购自南京伟沃生物科技有限公司，Integrin β3、β1由Chemicon公司提供，MMP-2、MMP-9购自Calbiochem公司。重组人P选择素糖蛋白配体1（rhPSGL-1）购自上海嵘崴达实业有限公司，货号3345-PS-050。
1.2 细胞人源乳腺癌细胞MDA-MB-231购于ATCC细胞库；人脐静脉内皮细胞株HUVECs，购于南京凯基生物科技有限公司。
1.3 仪器SPECTRA MAX 190可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司）；DM1L莱卡倒置荧光显微镜（德国莱卡公司）；P2精密移液器（法国吉尔森公司）；MLS-3020全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司）；525BR027843电泳槽（美国Bio-Rad公司）；SW-CJ-ZFD超净工作台（苏净集团安泰公司制造）；Nu－6511超低温冰箱（美国纽艾尔公司）；3111型CO2培养箱（FORMA）；S/N 020579纯水仪（美国Spring公司）；BT323S电子天平（德国赛多利斯有限公司）；KA-1000离心机（上海安亭科学仪器厂）。
2 方法 2.1 细胞培养MDA-MB-231细胞，用含10%胎牛血清、青霉素（1×105 U/L）以及链霉素100 mg/L的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行常规扩增培养。HUVECs用含10%胎牛血清、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培养基培养。
2.2 虚拟评价橙皮素与癌栓形成中关键蛋白的结合力采用Autodock分子对接软件包（版本4.2）进行分子对接，将橙皮素与P-选择素进行计算机虚拟结合，在此基础上评价橙皮素与P-选择素的结合参数。
2.2.1 准备橙皮素配体文件运用ACD/ChemSketch化学作图软件画出橙皮素及极性分子苯胺分子结构，并以MOL2文件格式导出保存。然后用UCSF Chimera分子图形软件制备分子（prepping molecules），将MOL2文件中橙皮素结构及苯胺分子进行加极性氢（essential hydrogen）、加电子、合并非极性氢原子、计算Gasteiger-Htiekel电荷等常规处理，最后使用MM2算法对橙皮素及苯胺分子的三维结构进行能量最小化优化［迭代次数1 000次，最小的均方根（RMS）梯度为0.10 nm］[11]。将能量最优化的即最稳定的橙皮素及苯胺分子结构转化生成PDB格式文件，以备使用。使用AutoDockTools（ADT）软件定义橙皮素分子及苯胺分子的柔性部分（可旋转键），以PDBQT格式存储，已备Autodock使用。
2.2.2 P-选择素蛋白的准备和处理从BIDD（Bioinformatics and drug design group）治疗性靶标数据库（Therapeutic Target Database）中寻找对接受体P-选择素，在Protein Data Bank搜索其晶体结构。Q-SiteFinder（http://www.modelling.leeds.ac.uk/qsitefinder/）以及metaPocket（http://metapocket.eml.org/）提交该蛋白PDB文件格式，在线预测出目的蛋白的活性位点[12]。采用AutodockTools软件中Select From String功能模块将目的蛋白中水分子剔除，利用Hydrogens模块对目的蛋白加极性氢原子及Kollman电荷，然后将目的蛋白与橙皮素配体进行分子对接。
2.2.3 对接计算的参数设置使用Autodock软件，应用拉马克（Lamarckian genetic algorithm，LGA）遗传算法，将局部能量搜索与遗传算法相结合，以半经验势函数作为能量打分函数，对小分子构象和位置进行全局搜索。对接选用的受体格点盒子大小为2.25 nm×2.25 nm×2.25 nm（60点×60点×60点），格点间距0.375 nm，格点盒子中心位于各个蛋白活性位点的中心。为提高底物分子在对接过程中的柔性程度，并使每次计算更为充分，以便得到更精确的结果，在对接过程中采用较大的运算参数，将该算法中的种群数ga_pop_size从默认值100调整为150，最大能量评估值ga_num_evals由默认值2 500 000调整为10 000 000，运算循环数从默认值10调整为100，其余参数使用默认数值。对接计算在3.75 nm×3.75 nm×3.75 nm的矩形框中进行[13]。
2.3 细胞增殖活性的检测人源乳腺癌细胞MDA-MB-231生长至90%融合后，用37 ℃预热的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用DMEM完全培养基重悬细胞进行计数，调整细胞浓度为每孔5×103个细胞接种于96孔板中。待第2天细胞单层贴壁后加入橙皮素，使给药组终浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.001 μmol/L。对照组加入20 μL PBS，每个药物浓度设4个复孔。在考察P-选择素对MDA-MB-231生长的影响时，每孔加入P-选择素，使其终质量浓度分别为10、30、50、70、90、100、120、150、200 ng/mL。将培养板放回细胞培养箱，24 h后加入20 μL MTS（终质量浓度333 μg/mL）溶液，继续在培养箱中孵育3 h。摇床避光震摇15 min，用全自动酶标仪在490 nm测定吸光度（A）值，计算细胞增殖率（给药组A值/对照组A值）。
2.4 橙皮素对活化的血小板表面P-选择素分泌的影响取5 mL血小板悬液，800 r/min常温离心8 min得血小板沉淀，离心前加入1 μmol/L前列腺素E1（PGE1）防止血小板激活。制备悬浮血小板到合适的浓度（1×108个/mL），加入10 μL含橙皮素0、0.01、0.1、1 μmol/L的药液，孵育30 min，每组3个复孔。实验测定前用凝血酶（0.05 U/mL）激活[14]。取上述血小板悬液，3 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。按照说明书（人P-选择素ELISA试剂盒，上海研谨生物科技有限公司，货号F00382）标准品的稀释方法制备标准品的稀释液，在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50 μL，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL，37 ℃反应30 min。弃去液体，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。37 ℃，温育30 min。弃去液体，每孔加体积为30倍的洗涤液，振荡30 s后甩去洗涤液，用滤纸拍干洗涤液。每孔加50 μL显色剂A，再加50 μL显色剂B，轻微振荡使其混匀，在避光条件下37 ℃显色10 min。依序每孔加50 μL终止溶液终止反应。用空白孔调零，用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的A值。在加终止液后15 min以内进行检测[15]。
2.5 橙皮素对P-选择素诱导的MDA-MB-231细胞迁移能力的影响实验前24 h对MDA-MB-231细胞进行撤血清饥饿。用37 ℃预热的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用无血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×106/mL。在24孔板下室中加入600 μL DMEM培养基，取90 μL上述细胞悬液加入Transwell小室上室中，同时各孔中加入初始浓度分别为0.1、1、10 μmol/L的橙皮素药液，体积10 μL，终浓度为0.01、0.1、1 μmol/L，对照组加入等体积的PBS，阳性对照组加入rhPSGL-1，终质量浓度为70 ng/mL[16]，除对照组外，其余各组每孔加入P-选择素使得终质量浓度为70 ng/mL，同时设单独P-选择素组，每组设置3个复孔。最后将Transwell小室浸于24孔板的培养液中，在培养箱中孵育6 h后，取出Transwell小室，用镊子取下滤膜，用4%多聚甲醛在冰上固定10 min，取出用0.1%的结晶紫染液在水平摇床上染色30 min，用PBS在水平摇床上漂洗3次，用棉签擦掉膜上层未迁移过的MDA-MB-231细胞，置于载玻片上，200倍镜下观察细胞迁移情况并拍照。显微镜下随机选取5个视野，统计迁移细胞数目[17]。
2.6 橙皮素对P-选择素介导的MDA-MB-231细胞与HUVECs细胞黏附的影响取对数生长期MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于6孔板中，待MDA-MB-231细胞生长至80%融合，除对照组外，每孔加入P-选择素使得终质量浓度为70 ng/mL，实验组再加入橙皮素终浓度为0、0.01、0.1、1 μmol/L，对照组加入等体积的PBS，阳性对照组加入rhPSGL-1，终质量浓度为70 ng/mL。放于培养箱中培养24 h。取对数生长期的HUVECs，调整细胞浓度至1×105 个/L。每孔1×104个细胞数，接种于96孔板中，培养箱中静置24 h。将6孔细胞培养板取出，弃培养基，PBS洗涤2次，用37 ℃预热的0.25%胰蛋白酶消化，完全培养基重悬MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，台盼蓝染色法检测MDA-MB-231细胞活力后，以每孔100 μL体积加入到已弃培养基的包被有HUVECs的96孔板中，培养箱中继续静置30 min。然后PBS洗掉未黏附细胞，每孔加入200 μL 0.1%虎红染液，室温下孵育30 min，弃染液，PBS洗涤，每孔加入95%乙醇- PBS（1∶1）200 μL，摇床上震荡15 min，于562 nm酶标仪测定A值[18]，计算相对黏附率（给药组A值/对照组A值），每个给药剂量设6个复孔，实验重复3次。
2.7 对P-选择素诱导的MDA-MB-231细胞Integrin-MMP与PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响取对数生长期MDA-MB-231细胞用预热0.25%胰蛋白酶消化并调整制成1×109个/mL细胞悬液，接种于75 mm2培养皿中，每个培养皿加入1 mL MDA-MB-231细胞悬液，并加入9 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，共10 mL培养体系。细胞分组及给药方式同“2.6”项，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后裂解细胞提取总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度。蛋白变性后取30 μg上样，用8%分离胶、5%浓缩胶电泳，电泳条件为0.02 A每块胶，电泳结束后将膜上蛋白转到PVDF膜上。PVDF膜用一抗（稀释比例为1∶500），4 ℃孵育过夜后加辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG（1∶10 000）室温孵育2 h。按0.1 mL/cm2加入化学发光试剂[19]。用Kodak胶卷暗室进行发光曝光，以GAPDH作为蛋白条带内参，对蛋白条带进行灰度比值分析，实验共重复3次。
2.8 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，结果以x±s表示，各组间的比较采用单因素方差分析，样本均数间的比较采用LSD-t检验。
3 结果 3.1 对接结果与评价在虚拟分子对接过程中，Autodock软件将10个不同空间构象的橙皮素分别于目的蛋白P-选择素在活性口袋进行计算机模拟拟合，之后软件对橙皮素与P-选择素蛋白结合进行评分，其对接示意图见图 1，计算机虚拟对接情况见表 1。
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图 1 橙皮素与P-选择素结合示意图 Fig.1 Schematic views of hesperetin combined with P-selectin |
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表 1 计算机分子虚拟对接中结合能量参数 Table 1 Parameters of binding energy values by computer virtual docking |
在表 1中，发现橙皮素与P-选择素的对接能量接近对照物岩藻糖与P-选择素的结合能力数值，表明橙皮素与P-选择素有较好的亲和力。选用极性分子苯胺与P-选择素进行分子对接[20]，以排除极性分子苯胺与P-选择素的非特异性结合，根据结合能的差异进一步佐证橙皮素与P-选择素的特异性结合。鉴于计算机虚拟对接橙皮素能较好地与P-选择素结合，因此进一步开展实验考察橙皮素对P-选择素下游调控信号通路的影响。
3.2 橙皮素及P-选择素对MDA-MB-231细胞增殖的影响MTS测定结果显示，橙皮素在5 μmol/L时对MDA-MB-231的生长有明显抑制作用，抑制率为26.98%，而在0.001～1 μmol/L对MDA-MB-231的生长无影响（图 2）。体外不同质量浓度的P-选择素处理MDA-MB-231细胞24 h，P-选择素对细胞增殖均无抑制作用。因此在考察橙皮素对P-选择素诱导的MDA-MB-231细胞迁移及黏附生物学影响时，选用P-选择素对MDA-MB-231增殖无影响的质量浓度即70 ng/mL（图 3）。
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与对照组 (0 μmol·L−1) 比较：**P＜0.01 **P < 0.01 vs control group (0 μmol·L−1) 图 2 橙皮素对MDA-MB-231细胞增殖的影响 (x±s±s,n = 4) Fig.2 Effect of hesperetin on MDA-MB-231 proliferation (x±s,n = 4) |
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与对照组 (0 ng·mL−1) 比较：*P＜0.05 *P < 0.05 vs control group (0 ng·mL−1) 图 3 P-选择素对MDA-MB-231细胞增殖的影响 (x±s±s,n = 4) Fig.3 Effect of P-selectin on MDA-MB-231 proliferation (x±s,n = 4) |
3.3 橙皮素对活化的血小板表面P-选择素分泌的抑制作用
结果见表 2。与凝血酶激活对照组（橙皮素0 μmol/L）相比，橙皮素0.01～1 μmol/L处理凝血酶激活的血小板后，上清中P-选择素的量被显著降低。橙皮素（0.01～1 μmol/L）对凝血酶激活的血小板P-选择素的释放具有抑制作用。
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表 2 橙皮素对凝血酶激活P-选择素分泌的影响 (x±s±s,n = 3) Table 2 Effect of hesperetin on secretion of P-selectin in thrombin activated platelets (x±s,n = 3) |
3.4 橙皮素抑制P-选择素诱导的MDA-MB-231迁移
结果见图 4，镜下观察可见P-选择素诱导的（橙皮素0 μmol/L）迁移过膜下的MDA-MB-231细胞数目较多，有的地方成片，橙皮素干预6 h后，各给药组在相同倍数显微镜下观察，肉眼可见细胞数目少于P-选择素组。实验数据定量分析表明，与P-选择素组相比，橙皮素明显抑制P-选择素诱导的MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移能力（P＜0.01）。
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与对照组比较：##P＜0.01；与P-选择素组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，图 5同 ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs P-selectin group,figure 5 is same 图 4 橙皮素对P-选择素诱导的MDA-MB-231细胞迁移的影响 (x±s±s,n = 3) Fig.4 Effect of hesperetin on migration of MDA-MB-231 cells induced by P-selectin (x±s,n = 3) |
3.5 橙皮素阻断P-选择素介导的MDA-MB-231与内皮细胞黏附
肿瘤细胞穿越血管，需要与血管内皮细胞黏附，P-选择素可以显著增强肿瘤细胞与内皮细胞黏附的能力，图 5显示橙皮素可以浓度依赖性地降低P-选择素介导的MDA-MB-231细胞与内皮细胞的黏附率。
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图 5 橙皮素对MDA-MB-231细胞与HUVECs黏附的影响(x±s±s,n = 6) Fig.5 Effect of hesperetin on MDA-MB-231 adhesion to HUVECs in vitro (x±s,n = 6) |
3.6 橙皮素抑制P-选择素调控的Integrin-MMPs信号通路
如图 6所示，实验各组GAPDH的条带灰度相近，图 6中Integrin β3、Integrin β1、MMP-2、MMP-9在橙皮素处理细胞后，相比其亮度有明显差别，可见有明显的减弱；同时图 6中相关信号通路蛋白的亮度和宽度可见有明显的减弱。实验结果证实橙皮素可以下调P-选择素诱导的MDA-MB-231细胞表面整合素分子Integrin β3、Integrin β1及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的蛋白表达，分子机制为抑制了P-选择素介导的PI3K-AKT-Paxillin-FAK-Src信号通路。
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图 6 橙皮素对P-选择素调控的Integrin β3、Integrin β1、MMP-2、MMP-9及介导的信号通路的影响 Fig.6 Effects of hesperetin on protein expression of Integrin β3,Integrin β1,MMP-2,and MMP-9 and its signaling pathway stimulated by P-selectin in MDA-MB-231 cells |
4 讨论
血小板在肿瘤转移过程中发挥重要促进作用，血小板可以与肿瘤细胞形成癌栓，避免患者免疫系统杀死肿瘤细胞，同时血小板会分泌一些生物活性因子调控肿瘤细胞的迁移、黏附等生物学行为。因此，抑制血小板对肿瘤细胞的作用是近年来研究的热点和重点[21]。大量的文献报道证实，血小板分泌的P-选择素是一类重要的促进肿瘤转移的生物活性因子，在肿瘤转移过程中，血小板来源的P-选择素能激活肿瘤细胞表面的整合素蛋白，调控MMPs的表达。虽然一些P-选择素拮抗剂已被发现，但由于半衰期短等原因限制了其在临床抗肿瘤治疗中的应用。如何从祖国传统中药中寻找出疗效好、不良反应小的抗肿瘤药物一直是科学研究者关注的重点。
计算机虚拟对接是发现先导化合物的重要手段之一，在本实验中采用计算机技术模拟橙皮素与P-选择素的结合，考察两者之间的亲和力。与阳性对照岩藻糖相比，数据结果显示橙皮素能较好地与P-选择素相结合。紧接着采用ELISA法考察橙皮素对活化的血小板分泌P-选择素的影响。P-选择素是调节肿瘤细胞迁移黏附的关键分子，它可以介导肿瘤细胞与血小板以及内皮细胞之间的黏附。ELISA检测法的结果发现橙皮素对活化的血小板P-选择素释放有一定影响，但药物作用不是很显著。
P-选择素与MDA-MB-231细胞表面的Mucin-1结合后，向肿瘤细胞内信号传导活化PI3K/AKT信号通路，上调Integrin β3及Integrin β1的表达。Intergrin高表达后经Paxillin/FAK/Src通路上调MMP-2/9的表达，进一步促进肿瘤细胞的迁移、黏附能力[22]。因为P-选择素介导了肿瘤细胞的迁移及黏附过程，因此推测橙皮素一旦结合了血小板分泌的P-选择素后，可能对MDA-MB-231细胞表面Intergrin以及MMPs的表达有调控作用。在恶性乳腺癌中，激活的Integrin β1、β3与MMPs相互协同控制了乳腺癌的转移。本研究采用Western blotting法检测了橙皮素对P-选择素刺激的MDA-MB-231细胞表面Integrin β1、β3表达的影响，发现橙皮素可以下调Integrin β1、β3的蛋白表达；进一步对整合素调控的MMP-2、MMP-9的蛋白表达进行了测定，发现橙皮素同时下调MMP-2、MMP-9的蛋白表达，初步说明了橙皮素具有下调P-选择素诱导的整合素以及MMPs表达的功能。进一步分子机制研究发现橙皮素对P-选择素调控的PI3K-AKT-Paxillin-FAK-Src信号通路同样具有抑制作用，这说明橙皮素可以作用于以上信号通路蛋白降低Integrin β3、β1以及MMP-2、MMP-9的蛋白表达。橙皮素正是通过对整合素的调控来抑制血行转移中血小板与MDA-MB-231细胞间的相互作用的。
本研究初步证实橙皮素能够通过竞争性与血小板分泌的P-选择素相结合，阻断P-选择素与MDA-MB-231细胞表面上Mucin-1结合，抑制PI3K-AKT-Paxillin-FAK-Src信号通路下调Integrin β1、β3以及MMP-2、MMP-9的表达，抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移及黏附。
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