中药指纹图谱技术是一种综合的、可量化的定性定量手段，具有“整体性”的特点，能全面反映中药提取状况^[1-2]，可用于中药提取工艺的优化。但由于中药化学成分的复杂性和多样性，中药提取物色谱峰较多，各峰权重系数难以确定，给综合评价带来了较大的困难。主成分分析（principal component analysis，PCA）法是一种浓缩数据、简化数据的统计学方法，该法利用降维思想，通过研究指标体系的内在结构关系，在不损失或尽量少损失原有指标信息的情况下把多指标转化成少数几个互相独立而且包含原有指标大部分信息的综合指标，有效地避免了综合评价时主观加权的弊端^[3-4]。因此，指纹图谱技术结合PCA既能解决目前普遍存在的工艺提取指标成分选择不全面的问题^[5]，又能将多指标数据进行简化，便于综合评价。

复方虎杖方由虎杖、黄柏、金钱草、茵陈、垂盆草、青黛、五味子7味中药组成，具有清肝利胆、降酶退黄之功效，临床上用于治疗肝纤维化及病毒性肝炎引起的肝胆湿热证^[6-7]以及复发性生殖器疱疹^[8]等。课题组前期优化了该方的水提工艺^[9]，但分析处方组成，该方的主要活性成分为脂溶性成分，如二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类成分^[10]；药效学实验进一步表明，醇提效果明显优于水提^[10]。因此本研究拟采用均匀设计方法，应用指纹图谱结合PCA技术优选复方虎杖方的醇提工艺，确定最适宜提取参数。

AT201型1/10万电子天平，瑞士梅特勒公司；Waters高效液相色谱仪，Alliance 2695四元泵及自动进样系统，2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，Milli-Q型纯水器，美国Millipore公司；BUCHI-200旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司；KQ-250E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；乙腈，色谱纯；超纯水，自制；其余试剂均为分析纯。虎杖、黄柏、金钱草、垂盆草、茵陈、青黛、五味子药材均购自安徽丰原铜陵中药饮片股份有限公司，经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定均符合《中国药典》2015年版一部相关规定，其中虎杖为蓼科蓼属植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. 的干燥根茎和根，黄柏为芸香科黄檗属植物黄皮树Phyllodendion chinese Schneid. 的干燥树皮，金钱草为报春花科马蹄金属植物过路黄Lysimachia christinae Hance的干燥全草，垂盆草为景天科景天属多年生草本植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge的干燥全草，茵陈为菊科蒿属植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kit. 的干燥地上部分，青黛为爵床科马蓝属植物马蓝Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek. 的叶或茎叶，五味子为木兰科五味子属植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill的干燥成熟果实。

按照处方比例称取复方虎杖方中的各味药材，共9份，每份含有1个处方量的药材111 g，分别将药材置圆底烧瓶中，按照表 1中条件回流提取，考察提取次数（X₁）、乙醇用量（X₂）、乙醇体积分数（X₃）、提取时间（X₄）对提取效果的影响。合并提取液，减压回收乙醇至500 mL，冷藏备用。

表 1(Table 1)

表 1 U9(93×31) 均匀设计因素与水平 Table 1 Factors and levels of U9(93 × 31) uniform design 水平 X1/次 X2/倍 X3/% X4/h 1 1 6 50 0.50 2 1 7 55 0.75 3 1 8 60 1.00 4 2 9 65 1.25 5 2 10 70 1.50 6 2 11 75 1.75 7 3 12 80 2.00 8 3 13 85 2.25 9 3 14 90 2.50

表 1 U9(93×31) 均匀设计因素与水平 Table 1 Factors and levels of U9(93 × 31) uniform design

精密吸取上述不同提取条件下制备的提取液2 mL，置10 mL量瓶中，加无水乙醇至近刻度，超声10 min（功率250 W），放至室温，定容至刻度，高速离心10 min（12 000 r/min），取上清液作为供试品溶液。

色谱柱为Alltima C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水；体积流量为1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 μL；检测波长254 nm；梯度洗脱程序：0～35 min，10%～45%乙腈；35～60 min，45%～90%乙腈；60～70 min，90%乙腈；70～72 min，90%～10%乙腈；72～82 min，10%乙腈。

取均匀设计4号实验提取条件下的供试品溶液连续进样6次，每次20 μL，计算各共有色谱峰的保留时间和峰面积的RSD，结果表明22个共有峰的保留时间和峰面积的RSD分别为0～0.03%、0～0.53%，说明仪器精密度良好。

取均匀设计4号实验条件下的提取液，制备供试品溶液，重复6份，分别进样20 μL，计算各共有峰的保留时间和峰面积的RSD，结果表明22个共有峰的保留时间和峰面积的RSD分别为0～0.02%、0.09%～0.67%，说明该实验方法重复性好。

取均匀设计4号实验提取条件下的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样20 μL，计算各共有峰的保留时间和峰面积的RSD，结果表明22个色谱峰的保留时间和峰面积的RSD分别为0～0.03%、0.003%～0.480%，说明供试品溶液在12 h内稳定。

分别吸取9个样品的供试品溶液各20 μL，在上述色谱条件下分别进样测定，记录色谱图，采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版）对图谱初步分析，确定了22个共有色谱峰，见图 1。

图 1 不同提取条件下9个样品的HPLC指纹图谱 Fig.1 HPLC fingerprint of nine samples with different ethanol extraction conditions

采用SPSS 17.0对均匀设计的各组样品的峰面积进行降维处理，获取能代表原始峰面积的主成分及贡献率，解释的总方差见表 2。根据主成分的提取原则，取特征值λ＞1的特征根对应的成分作为提取主成分。因此选取的前4个成分的初始特征值分别为13.031、4.308、1.628、1.337，方差贡献率分别为59.230%、19.581%、7.402%、6.075%，累积方差贡献率为92.288%，说明提取的4个主成分可以代表原始色谱峰峰面积的大部分（92.288%）信息。

表 2(Table 2)

表 2 解释的总方差 Table 2 Total variance explained of extracted components 主成分 初始特征值 提取平方和载入 合计 方差/% 累积贡献率/% 合计 方差/% 累积贡献率/% 1 13.031 59.230 59.230 13.031 59.230 59.230 2 4.308 19.581 78.811 4.308 19.581 78.811 3 1.628 7.402 86.213 1.628 7.402 86.213 4 1.337 6.075 92.288 1.337 6.075 92.288 5 0.769 3.496 95.784 6 0.434 1.972 97.756 7 0.352 1.600 99.357 8 0.079 0.357 99.713 9 0.063 0.287 100.000

表 2 解释的总方差 Table 2 Total variance explained of extracted components

以提取的4个主成分的因子得分乘以相应的方差算数平方根得到4个主成分的得分，即主成分1得分（F₁）＝主成分1因子得分×初始特征值的算数平方根，以此类推得到主成分2、3、4得分（F₂、F₃、F₄）。按照公式可以分别计算均匀设计9个样品的综合得分，结果见表 3。由表 3可以看出6号样品综合得分最高，表明其提取条件为最适宜。

表 3(Table 3)

表 3 U9(93×31) 均匀设计方案与结果 Table 3 Test and results of U9(93 × 31) uniform design 试验号 X1/次 X2/倍 X3/% X4/h 综合得分 S1 1 7 65 2.00 −5.2 S2 1 9 85 1.50 −3.8 S3 1 11 60 1.00 −5.3 S4 2 13 80 0.50 −3.2 S5 2 6 55 2.25 1.5 S6 2 8 75 1.75 5.8 S7 3 10 50 1.25 3.6 S8 3 12 70 0.75 4.6 S9 3 14 90 2.50 3.0

表 3 U9(93×31) 均匀设计方案与结果 Table 3 Test and results of U9(93 × 31) uniform design

F＝0.641 80 F₁＋0.212 17 F₂＋0.080 18 F₃＋0.065 85 F₄

为了揭示多个因素对指标的内在关系，采用SPSS 17.0统计软件对均匀设计试验结果进行逐步回归分析，建立回归模型，所建模型评价结果见表 4。由概率值P＜0.05可知，拟合的回归方程具有统计学意义。

表 4(Table 4)

表 4 模型回归方差分析 Table 4 Variance analysis of model regression 因素 平方和 自由度 均方差 F值 P值 回归 157.834 7 22.548 451.897 0.036 残差 0.050 1 0.050 总误差 157.884 8

表 4 模型回归方差分析 Table 4 Variance analysis of model regression

各变量对回归模型的贡献及意义见表 5。由表 5中数据可得到回归方程为Y＝−36.749＋2.101 X₁－0.273 X₂²＋0.180 X₁X₃＋6.121 X₂－0.001 X₃²－1.183 X₁X₂＋1.252 X₁²，r＝0.997，以Y为评价指标时，同时考虑各变量之间存在的交互作用，回归方程选入X₁、X₂²、X₁X₃、X₂、X₃²、X₁X₂、X₁²变量，说明这7个变量（即提取次数、溶剂倍量2次方交互项、提取次数和乙醇体积分数交互项、溶剂倍量、乙醇体积分数2次方交互项、提取次数和溶剂倍量交互项、提取次数2次方交互项）对复方虎杖方醇提取工艺效果影响比较显著。由回归模型中各变量的显著性检验可推知单一变量对Y的影响大小为溶剂倍量＞提取次数＞乙醇体积分数＞提取时间。

表 5(Table 5)

表 5 各变量的统计检验 Table 5 Statistical test of each variables 模型 未标准化系数 标准化系数 T检验 P值 回归系数 标准误差 常数项 −36.749 1.856 −19.804 0.032 X1 2.101 0.900 0.410 2.335 0.058 X22 −0.273 0.025 −3.384 −11.012 0.058 X1X3 0.180 0.010 2.803 17.761 0.036 X2 6.121 0.381 3.773 16.050 0.040 X32 −0.001 0.000 −0.480 −8.169 0.078 X1X2 −1.183 0.140 −3.419 −8.477 0.075 X12 1.252 0.385 0.986 3.254 0.190

表 5 各变量的统计检验 Table 5 Statistical test of each variables

根据最优回归方程用Excel 2003进行规划求解，得到各个变量的取值为X₁＝3，X₂＝6，X₃＝90，组合条件最优，求得Y＝26.93。由于X₄对复方虎杖方醇提取工艺效果影响不是特别显著，根据实际实验操作过程中的条件优选X₄＝1，所以确定的最优的醇提工艺条件为用6倍量的90%乙醇提取3次，每次1 h。

按照处方比例，称取同一批药材3份，每份111 g，按照优选的提取工艺进行验证试验，依法制备供试品并测定，综合分析各共有峰面积得到3份样品的平均综合得分为5.6，RSD为0.5%，表明优选的提取工艺条件稳定可行。

现代中药提取工艺研究常常会选择出膏率、某1个或数个指标成分^[12,-15]，亦或出膏率与指标成分综合评分^[16-21]作为考察指标进行工艺优化。一方面，以出膏率作为指标，对水提工艺有一定的参考意义，反映了药材提取的程度，但对醇提指导意义不大，通常醇浓度越高，出膏率越低，因此不能反映药材的提取程度；另一方面，由于复方中药组成药味较多，成分复杂，是由许多活性成分协同发挥作用的，因此在研究提取工艺时选择一个或几个指标成分远远不够。

中药指纹图谱是一种反映中药中所有化学成分的定性定量技术，主要以色谱峰的相对保留时间和相对峰面积进行定性，以峰面积进行半定量，可以被广泛应用于中药从药材到产品的整个提取分离过程中^[20]。由于指纹图谱涵盖的信息量大，与目前普遍采用的出膏率、一个或几个指标成分作为考察指标相比，具有全面性与综合性，更加能反映提取的效果^[21]。本研究优化了分离条件，建立了复方虎杖方指纹图谱，确定了22个提取物的共有峰，用作工艺优化的指标成分，方法学研究结果表明，所建立的指纹图谱方法精密度、稳定性、重复性均较好，可用于指标成分的定量分析。

选择复方虎杖方指纹图谱中22个谱峰作为工艺优化的考察指标，数据繁琐，各峰权重系数难以确定，给综合评价带来了较大的困难。采用PCA法，通过线性变换，将原来的22个指标组合成4个能充分反映总体信息的指标（涵盖了原始色谱峰92.288%的信息），从而在不丢掉原来主要信息的前提下，避开了变量间共线性的问题，这种浓缩数据、简化数据的统计学方法为进一步进行均匀设计数据回归分析奠定了基础^[22-23]。

本研究首次将指纹图谱技术与PCA统计学方法相结合，用于中药提取工艺优选，既全面考察了药材提取状况，又简化了数据处理，适合中药水提、醇提工艺考察，具有一定的实用性。