葛花Puerariae Flos为豆科葛属植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth. 的花，主要用于伤酒发热烦渴、解酒醒脾，是传统的解酒保肝中药^[1-3]。鸢尾苷元为葛花的主要生物活性成分，为三羟基异黄酮。因其多酚羟基结构，而具有强抗氧化活性，4′,7-羟基结构与乙烯雌酚相似，拥有雌激素样活性。现代药学研究发现，鸢尾苷元具有抗氧化损伤、降血糖、调血脂、抗炎、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、心肌保护作用和防治糖尿病并发症等多种生物活性，有重要的保健和药用价值^[4-11]。

黄酮类化合物因水溶性差，生物利用度低^[12-13]，限制了其临床应用。胃内滞留漂浮缓释制剂被称为“生物有效性制剂”，是依据流体动力学平衡原理设计制备，口服后可漂浮在胃液之上，延长胃内滞留时间，逐渐溶蚀，缓慢释药，继而增加吸收，提高生物利用度^[14-16]。

笔者利用鸢尾苷元呈弱酸性，主要在胃内吸收的特性，制备鸢尾苷元胃内漂浮缓释片（tectorigenin floating sustained-release tablets，TFSRT），延长药物在胃内的滞留时间，以提高其生物利用度。本实验以鸢尾苷元悬浮液作为参比制剂，并以鸢尾苷元为检测指标，采用HPLC法测定体外累积释放度和兔体内血药浓度，从而评价该制剂体外释放与体内吸收的相关性，为利用体外释放度控制该制剂质量提供依据。

1 仪器与材料

LC-10AVT高效液相色谱仪、SPD-10AV检测器，日本岛津公司；N-2000色谱数据工作站，浙江大学智能信息工程有限公司；CPA2P-F百万分之一电子分析天平，德国赛多利斯股份有限公司；ZRS-4G智能溶出试验仪，天津大学无线电厂；TDP型单冲压片机，上海轻工机械公司；78-X型片剂四用测定仪，上海黄海药检仪器厂。ZK-82B型真空干燥箱，上海市实验仪器厂。

鸢尾苷元对照品，自制，经质谱、氢谱和碳谱进行结构鉴定，质量分数＞99.0%，批号20130906；鸢尾苷元，自制，批号20131017，质量分数＞96.75%；β-葡萄糖醛酸酶，Sigma公司；醋酸泼尼松龙注射液，浙江仙琚制药股份有限公司，批号150307，规格：125 mg/5 mL；羟丙甲基纤维素（HPMC_K15M），上海卡乐康包衣技术有限公司惠赠；预胶化淀粉、十八醇、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上海化学试剂公司；碳酸氢钠，北京化工厂；水为重蒸水；甲醇、乙腈为色谱纯，Tedia公司；其他试剂均为分析纯，北京化工厂。

日本大耳白兔，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，吉林大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（吉）2011-007。

2 方法与结果 2.1 TFSRT 的制备^[15]

取鸢尾苷元干粉和十八醇过80目筛，按处方量称取主药及辅料，过60目筛，混合均匀。加润湿剂制软材，过18目筛制粒，60 ℃干燥20 min，14目筛整粒，加入1%硬脂酸镁混匀，用直径10 mm的冲头压片，压力控制在4.0～5.0 kg，所得成品为外观光洁的浅黄色片剂，300 mg/片，含主药100 mg。

2.2 体外释放度实验 2.2.1 色谱条件^[17]

色谱柱为Agilent C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-水（2∶1∶2）；体积流量1.0 mL/min；检测波长264 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL。

2.2.2 系统适用性试验

取TFSRT持续漂浮6 h的人工胃液，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μL，见图 1。理论塔板数不低于3 000，分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，保留时间为7.565 min。

2.2.3 线性关系考察

精密称取干燥至恒定质量的鸢尾苷元对照品12 mg置100 mL量瓶中，加人工胃液适量，超声助溶10 min，用人工胃液定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为120 μg/mL的鸢尾苷元对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，以人工胃液定容于10 mL量瓶中，摇匀，取20 μL，HPLC法测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程为Y＝63 725 X－ 33 233，r＝0.999 8，表明鸢尾苷元在1.2～120.0 μg/mL线性关系良好。

2.2.4 精密度试验

取12.0 μg/mL的鸢尾苷元对照品溶液连续进样6次，测得其峰面积的RSD为1.09%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验

精密吸取同一供试品溶液，重复进样6次，测得峰面积的RSD为1.48%，结果表明本方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，室温放置0、1、2、4、6、12 h后取样测定，RSD为1.29%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.7 加样回收率试验

精密称取缓释片细粉3份（8.00、10.00、12.00 mg）分别置100 mL量瓶中，精密加入质量浓度为120 μg/mL的鸢尾苷元对照品溶液20、25、30 mL，加释放介质溶解，超声处理10 min，并定容至刻度。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别进样20 μL，测定峰面积，计算加样回收率。平均回收率分别为99.34%、97.58%、98.06%，其RSD分别为3.23%、1.56%、1.75%。

2.2.8 体外释放度的测定

取本品照《中国药典》2015年版二部释放度测定法，采用浆法，以人工胃液^[18-19]（十二烷基硫酸钠5 g，用适量水分散，加热溶解，放冷，加入16.4 mL稀盐酸，加水稀释成1 000 mL，模拟胃肠道的pH值变化，配制成满足漏槽条件的人工胃液）900 mL为释放介质，转速100 r/min，温度（37.0±0.5）℃，依法测定。分别于2、4、6、8、10、12 h取样2 mL，并即时补加等量等温介质。经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μL进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，代入回归方程，计算药物累积释放度，见表 1。结果表明，TFSRT在人工胃液中10 s内起漂，体外持续漂浮时间＞12 h；10 h累积释放度在70%以上；具有良好的漂浮性能和释药特征。

2.3 兔体内药动学研究 2.3.1 给药方法

采用交叉试验设计，自身对照进行实验。将6只日本大耳白兔，分为2组，分别ig给予TFSRT 2片和鸢尾苷元混悬液200 mg^[20-21]。实验前禁食12 h，自由饮水。ig后给水约100 mL。实验共分2个周期，洗净期7 d。

2.3.2 血样采集

给药前用桡动脉穿刺套针行耳中央动脉穿刺，穿刺成功后，拔出针芯，充分固定针套，用肝素帽封针并取血。给药后5 min及0.25、0.5、1、2、3、4、6、10、12 h于耳中央动脉取血，置肝素化离心管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，−20 ℃保存待测。

2.3.3 血浆预处理

家兔禁食12 h，自由饮水。耳中央动脉取血20 mL，置肝素化离心管中，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，备用。

2.3.4 线性关系考察

精密称取干燥至恒定质量的鸢尾苷元对照品8 mg，加无水乙醇溶解并定容于100 mL量瓶中，充分混匀。等比稀释得到0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL不同质量浓度的对照品溶液。各取200 μL，每管加入空白兔血浆0.8 mL和含有内标（醋酸泼尼松龙12.5 μg/mL）的无水甲醇溶液200 μL，混匀。加入醋酸乙酯1.2 mL，涡旋震荡3 min，10 000 r/min离心5 min，分离上层有机相1.0 mL转入另一试管中。再加入醋酸乙酯1.0 mL，涡旋震荡，离心取上层有机相1.2 mL。合并有机相，于通风橱中水浴挥干，残渣加100 μL流动相溶解，取20 μL进样HPLC分析，色谱条件同“2.2.1”项。测定鸢尾苷元与内标峰面积之比。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品与内标峰面积之比为纵坐标（Y）进行回归，得回归方程为Y＝0.417 2 X＋0.424 1，r＝0.999 6，结果表明鸢尾苷元在0.16～20.00 μg/mL线性关系良好。

2.3.5 精密度试验

取0.8 mL空白血浆，分别加入2.5、5.0、10.0 μg/mL鸢尾苷元对照品溶液200 μL，制成低、中、高3个质量浓度，加入12.5 μg/mL醋酸泼尼松龙甲醇溶液200 μL，涡旋混匀，按标准曲线方法处理并测定，重复进样6次，分别记录鸢尾苷元与内标峰面积比，计算精密度，结果低、中、高3个质量浓度的RSD分别为2.66%、1.62%、1.22%，表明所用分析方法符合要求。

2.3.6 稳定性试验

取0.8 mL血浆样品，加入6.25 μg/mL醋酸泼尼松龙甲醇溶液400 μL，涡旋混匀。按标准曲线方法处理。室温放置，分别在0、2、4、6、8 h取样，按上述色谱条件检测。结果RSD为2.30%，表明室温放置8 h稳定性良好。

2.3.7 提取回收率试验

取0.8 mL空白血浆共9份，分别加入质量浓度为2.5、5.0、10.0 μg/mL鸢尾苷元对照品溶液200 μL，制成低、中、高3个质量浓度的血浆样品，加12.5 μg/mL醋酸泼尼松龙甲醇溶液200 μL，涡旋混匀。按标准曲线方法处理并测定，记录样品与内标的峰面积之比，代入标准曲线，计算提取回收率。结果表明低、中、高3个质量浓度的平均提取回收率均在96.44%～103.36%，RSD为0.85%～1.95%，说明该方法准确可靠。

2.3.8 专属性试验

按“2.2.1”项色谱条件下测得空白血浆、空白血浆加鸢尾苷元对照品和内标及血浆样品的HPLC图谱。可见多次进样，含药血浆及内标的峰形及保留时间重现性好，保留时间分别为7.865、11.932 min，空白血浆中内源性物质不干扰测定。结果见图 2。

2.3.9 血药浓度测定

取血浆样品0.8 mL，加200 μL β-葡萄糖醛酸酶（4 000 U/mL），充分混匀后，37 ℃水浴24 h。加入6.25 μg/mL醋酸泼尼松龙甲醇溶液400 μL混匀，按血浆中标准曲线法处理并测定，记录鸢尾苷元与内标峰面积比，计算血浆中不同时间点的药物质量浓度，结果药物质量浓度-时间曲线见图 3。

2.3.10 药动学参数

所得兔血药浓度数据采用PK solver2.0药动学程序软件进行拟合分析，主要药动学参数见表 2。结果TFSRT的达峰时间（t_max）滞后于悬浮液2 h以上，峰浓度仅为悬浮液的65.38%。TFSRT的吸收速率常数（K_a）显著小于悬浮液（P＜0.01），体内平均滞留时间（MRT）显著延长（P＜0.01），具有明显的缓释特征。以鸢尾苷元悬浮液为参比制剂，TFSRT的相对生物利用度为（134.63±27.94）%，相对于鸢尾苷元悬浮液具有较大程度的提高（P＜0.05）。

2.4 TFSRT 体内外相关性研究

采用Wagner-Nelson法^[22]计算TFSRT体内吸收分数（吸收百分数），同批号的TFSRT的体外累积释放百分率（Y）对体内吸收分数（X）回归，回归方程为Y＝1.062 2 X＋8.791 9，r＝0.987 9。

3 讨论

胃内滞留漂浮制剂可延长药物胃内滞留时间，减少给药次数，增加患者依从性^[23]。鸢尾苷元为葛花异黄酮有效成分，呈弱酸性，主要在胃内吸收，吸收速度快，半衰期短，适宜制备胃内滞留漂浮缓释制剂。

本实验建立了兔体内TFSRT血药浓度的分析方法，并进行了兔体内药动学的初步评价。采用甲醇沉淀蛋白，醋酸乙酯萃取法提取药物，可减少内源性物质对药物测定的干扰，该法操作简便，能明显提高回收率。鸢尾苷元吸收后主要以葡萄糖醛酸结合形式存在^[24]，通过β-葡萄糖醛酸酶酶解将结合型鸢尾苷元转化为游离型，增加血浆中总鸢尾苷元血药浓度，提高检测的敏感性和准确性。HPLC法测定兔体内鸢尾苷元血药浓度，操作简便，分析方法的准确度和精密度较高，方便快捷。

经兔口服TFSRT和鸢尾苷元悬浮液后，检测不同时间点的血浆中鸢尾苷元质量浓度，计算药动学参数如下：TFSRT的t_max、C_max和AUC分别为 （2.809±0.371）h、（6.317±1.337）μg/mL和 （74.156±10.420）μg∙h/mL。鸢尾苷元悬浮液的t_max、C_max和AUC分别为（0.442±0.138）h、（9.662±2.759）μg/mL和（57.059±13.309）μg∙h/mL。t检验结果表明，2种制剂的t_max、C_max和AUC均有显著差异（P＜0.05）。TFSRT的t_max滞后于悬浮液2 h以上，峰浓度仅为悬浮液的65.38%。TFSRT的吸收K_a 显著小于悬浮液（P＜0.01），体内MRT显著延长（P＜0.01），具有明显的缓释特征。

t_max、C_max和AUC数据经对数转换后进行双单侧t检验，以鸢尾苷元悬浮液为参比制剂，TFSRT的相对生物利用度为（134.63±27.94）%，相对于鸢尾苷元悬浮液具有较大程度的提高（P＜0.05）。分析其原因可能是由于鸢尾苷元主要在胃内吸收，悬浮液胃内停留时间短，部分药物未被吸收即排入肠道，肠道吸收能力差，而以原型随粪便排出体外有关。TFSRT达到了延长药物胃内滞留时间、提高生物利用度的剂型设计要求。其体内吸收与体外释放具有良好的相关性（r＝0.987 9），提示可用体外释放度来控制其制剂质量。