2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.02.006 |
地龙为钜蚓科（Megascolecidae）动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。前者习称“广地龙”，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效[1]，临床广泛用于癫痫、高血压、血栓性疾病、微循环障碍、支气管哮喘等疾病的治疗[2]，目前，有关广地龙成分研究已有相关文献报道[3-4]，包括氨基酸、有机酸、核苷酸、微量元素等。质量控制多集中于氨基酸的定量测定。单一的氨基酸难以有效控制药材质量，因此，明确广地龙主要化学成分组成对于有效评价及控制药材质量具有重要意义。另一方面，地龙作为一类动物药，区别于大多数以糖类、黄酮类、皂苷类等[5]为主要化学成分的植物药，明确广地龙药材主要化学成分对进一步研究其药效物质基础具有重要意义。
近年来，具高效分离能力的色谱和高分辨、高灵敏质谱串联技术已在多组分中药及复方成分快速定性分析中逐渐凸显出独特优势[6]。本实验采用超高液相色谱-质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）技术首次对广地龙药材全成分进行分析，根据各色谱峰的一级、二级质谱数据及相关数据库匹配和参考文献、对照品比对，明确各大类成分，以期阐明其药效物质基础，为其质量控制指标的选择提供科学依据。
1 仪器与试药BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；BSAZ24S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-300DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；超高效液相色谱仪（Waters公司）；AB SCIEX Triple-TOFTM5600＋高分辨质谱仪（美国AB SCIEX公司）；色谱甲醇、乙腈（Merck公司）；蒸馏水（广州屈臣氏公司）。
广地龙饮片（批号20141001）购自河北祁新中药颗粒饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为钜蚓科环毛属参环毛蚓Pheretima aspergillum E. Perrier的干燥体。对照品腺嘌呤（批号879-200001）、次黄嘌呤（批号140661-200903）、琥珀酸（批号110896-200001）均购自中国食品药品检定研究院。
2 方法 2.1 对照品溶液制备分别精密称取各对照品2.5 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2 供试品溶液制备取广地龙药材2.0 g，精密称定，加80%甲醇50 mL超声处理40 min（功率100 W，频率40 KHz），放冷至室温，补足甲醇，摇匀取上清离心12 000 r/min，10 min，取上清，0.22 μm滤膜滤过，即得。
2.3 色谱条件和质谱条件色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）梯度洗脱，洗脱程序：0～6 min，95%～70% A；6～10 min，70%～50% A；10～13 min，50%～30% A；13～14 min，30% A；14～20 min，30%～0 A；柱温35 ℃，体积流量0.3 mL/min，进样量3 μL。
质谱条件：电喷雾离子源，正、负离子模式下，正负离子源电压分别为5 500 V/−4 500 V；离子源温度为550 ℃；雾化气为N2，压力379.2 kPa，脱溶剂压力379.2 kPa，气帘气241.3 kPa；解簇电压分别为80 V/−80 V；碰撞能量CE分别为35 eV/−35 eV；TOF MS扫描范围为m/z 70～1 000；IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描；Product Ion扫描范围为m/z 45～1 000，开启动态背景扣除（DBS）；采集软件为Analyst TF 1.6 software。
2.4 数据分析根据Peakview 2.0工作站给出的高分辨精确质量数，依据实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差小于5×10−6的原则及同位素丰度比，确定各色谱峰对应化合物的分子式；前期根据国内外相关文献资料，查找并建立地龙药材包括中英文名称、分子式、精确相对分子质量、CAS号在内的成分数据库，通过与文献比对，快速确证可能的化学成分。与部分对照品的二级质谱数据对比，确认推断结果。对于一些无法获得对照品的化合物，依据MS/MS碎片信息以及文献报道，进一步推断。
3 结果正、负离子模式下采集的总离子流图（TIC）见图 1，各峰获得了良好的分离效果及离子化效率，从广地龙药材中推断出84种成分，见表 1，包括游离氨基酸11种，有机酸类26种（饱和脂肪酸8种、不饱和脂肪酸15种、其他3种），核苷类11种，二肽及环二肽5种和其他含氮类21种，其他类化合物10种。
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图 1 广地龙药材总离子流图 Fig.1 Total ion current chromatograms of P. aspergillum |
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表 1 广地龙药材成分分析结果 Table 1 Results of analysis of constituents of P. aspergillum |
3.1 氨基酸类
保留时间在0.77～2.78 min，正离子模式下，氨基酸的准分子离子峰 [M＋H]＋相对丰度较低，实验发现正离子模式下大多数氨基酸（除Arg外）失去NH3和COOH或OH，与文献报道[7]相符合，结合数据库搜索，共推断出11种氨基酸，分别为赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。
以20号峰对应的化合物为例，准分子离子峰132 [M＋H]＋丰度较低，易失去COOH和NH3形成较稳定的86 [M＋H－COOH]＋、69 [M＋H－COOH－NH3]＋碎片离子，m/z 69离子可在高能碰撞下产生一系列丰度比较低的子离子。综上信息，与文献报道[8]相结合，推断20号峰对应的化合物为亮氨酸，其二级质谱、可能的裂解途径见图 2和3。
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图 2 化合物20二级质谱图 Fig.2 MS/MS spectrum for compound 20 |
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图 3 亮氨酸的裂解途径 Fig.3 ESI-MS2 fragmentation pathway of leucine |
3.2 核苷类
核苷类是具有多样生理活性的一类水溶性物质，关于此类化合物质谱裂解规律的报道较少，本实验在正离子模式下共推测出11种核苷类化合物，以化合物9和16为例，化合物9的准分子离子268 [M＋H]＋丰度较低，易丢失1个呋喃糖C5H7O4，形成136的碎片离子，继续高能碰撞裂解失去NH3获得碎片离子m/z 119，与文献报道[9]符合，二级质谱图及可能的断裂方式见图 4、5。化合物16准分子离子137 [M＋H]＋丰度较高，二级碎片m/z 120、119、110分别失去1个NH3、H2O和HCN，进一步与对照品比对，二者相符，故推断化合物16为次黄嘌呤，可能的裂解方式见图 6、7。
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图 4 化合物9二级质谱图 Fig.4 MS/MS spectrum for compound 9 |
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图 5 腺苷的裂解途径 Fig.5 ESI-MS2 fragmentation pathway of adenosine |
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图 6 化合物16二级质谱图及对照品比对镜像图 Fig.6 MS/MS spectrum for compound 16 and regiolone reference |
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图 7 次黄嘌呤的裂解途径 Fig.7 ESI-MS2 fragmentation pathway of hypoxanthine |
3.3 二肽及环二肽类
从广地龙提取物中推断出包括丙氨酰苯丙氨酸、谷氨酰苯丙氨酸、亮氨酰苯丙氨酸、组氨酰天冬酰胺、环缩二亮氨酸共5种二肽及环二肽类物质。结合文献报道[10]并归纳总结了该类物质在ESI＋下的质谱裂解途径：（1）游离的NH3和COOH易丢失；（2）新形成的酰胺键易断裂或丢失CONH基团。如Ala-Phe、Glu-Phe、Leu-Phe三者均含有碎片离子m/z 103，为丢失NH3、COOH和CONH而形成，环缩二亮氨酸碎片离子m/z 184为丢失CONH形成。
3.4 有机酸类负离子模式下，tR 1.33、19.88 min分别得到m/z 117、269的2个 [M－H]− 质谱信号，前者出现m/z 99、73的碎片，分别为丢失1个H2O和CO2形成，与对照品谱图一致，推测其为琥珀酸，二级质谱图及可能的裂解方式见图 8、9。后者碎片离子m/z 225为丢失1个CO2形成，结合文献报道[11]，推测其为十七烷酸。正离子模式下，tR为17.87 min的峰得到m/z 255 [M＋H]＋，二级碎片有m/z 237，219，分别丢失1个H2O和CO2形成，m/z 219继续丢失1个C2H4基团形成 m/z 181，丢失1个C3H6形成m/z 167，文献报道[12]为典型的直链单烯的特征离子，故推测为棕榈烯酸。另外在t R 18.17 min，准分子离子峰 [M＋H]＋的m/z 331，碎片离子分别是m/z 313 [M＋H－H2O]＋、285 [M＋H－COOH]＋、275 [M－C4H7]＋、247 [M－C5H7O]＋，结合文献报道[13]，推断所对应的化合物为DPA。结合质谱数据推断，直链烷酸分子离子峰的丰度随着相对分子质量的增加而增加，易丢失H2O和COOH基团，且随着双键数目的增加不饱和脂肪酸的二级质谱碎片也逐渐复杂，双键位置不同的不饱和脂肪酸的质谱图差别不大。结合文献报道[14-15]，在正、负离子模式下，共推断出26种有机酸类，包括琥珀酸等8种饱和脂肪酸，油酸、棕榈烯酸等4种单不饱和脂肪酸，DPA、EPA等11种多不饱和脂肪酸及3种其他有机酸。
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图 8 化合物17二级质谱图及对照品比对镜像图 Fig.8 MS/MS spectrum for compound 17 and regiolone reference |
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图 9 琥珀酸的裂解途径 Fig.9 ESI-MS2 fragmentation pathway of succinic acid |
3.5 其他类化合物
根据Peakview 2.0和中药成分数据库、chemspider匹配及参考文献，本研究还从广地龙提取物中推断出了甾烯醇类[16]、环戊烯酮类[17]等一些其他化合物。
4 讨论实验考察了水、甲醇、80%甲醇、乙腈4种提取溶剂对提取效率的影响，结果表明80%甲醇最优。流动相考察了甲醇、乙腈、不同体积分数甲酸溶液的不同配比，结果发现用0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈得到的各个峰之间分离度更好。实验还对解簇电压（60 V、80 V）、碰撞能量（10 eV、20 eV）等质谱参数进行了优化，IDA采集模式下得到样品丰富碎片信息。
地龙具有抗肿瘤、降血压、调血脂、抗炎平喘等广泛的药理作用，临床疗效显著，成分丰富，有必要对其成分进行系统研究，本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术首次对广地龙提取物全成分进行分析，共推断出84个成分。其中26种有机酸类化合物，占30.95%，包括11种多不饱和脂肪酸（PUFAs），占13.09%；核苷类11种、二肽及环二肽5种和其他含氮类21种，其他类化合物10种。脂肪酸基本以酯的形式存在于生物体内，广地龙干品中存在大量的游离脂肪酸，可能是由于其中酶的分解作用导致，是细胞膜磷脂的主要成分，有预防和治疗心脑血管疾病作用。研究发现[18] n-3脂肪酸摄入高与骨密度高相关，特别是DHA，与骨矿自然增长量呈正相关。核苷及核苷类似物是一类具有抗肿瘤、抗病毒、肝损伤修复等作用的一类活性物质，据文献报道[19]嘌呤类具有舒张支气管平滑肌、抑制气道炎症、调节免疫作用。另外，二肽及环二肽类是具有抑菌、抗癌、抗凝、脑功能改善、调控食欲及能量改善等作用的自然界分布广泛的一类生物活性物质。
新型液质联用技术能快速、准确、较全面地分析中药及复方中的化学成分，大大缩短天然产物成分分析工作的研究周期，节约成本，为合理开发中药资源奠定基础。本实验运用UPLC-Q-TOF-MS技术，首次较全面地分析和确证了广地龙中小分子化学成分，为后续深入研究其药理作用及药效物质基础、更全面地开发应用该药提供了依据。
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