2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.01.002 |
2. 江苏省中医药研究院, 江苏 南京 210028;
3. 南京中医药大学 江苏省方剂高技术研究重点实验室/江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏 南京 210023
2. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China;
3. Jiangsu Province Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae and Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
斑马鱼（zebrafish）是一种器官、系统发育完善的良好实验模式鱼及模式材料。早在20世纪70年代末，Streisinger等[1]开始以斑马鱼幼鱼作为模式系统用于脊椎动物的遗传筛选[2]；20世纪80年代后，国际标准化组织和经济合作开发组织将斑马鱼推荐为标准实验用鱼，用于对环境卫生健康[3]和农药[4]的检测，随后的20多年，斑马鱼被广泛用于疾病模型及药学研究[5-9]。近年来，斑马鱼在药物毒性评价的应用日益盛行[10]，斑马鱼在国内外已成为一种热门的药学实验研究对象，被用来建立各种疾病模型进行药物活性、毒性的高通量筛选以及药物代谢等方面的研究[11]。国内学者已开始利用斑马鱼模型评价药物毒性，如许冰洁等[12]用斑马鱼胚胎评价5种已知对人类胚胎致畸药物的毒性与安全性，证实斑马鱼胚胎模型可用于初步评价药物的发育毒性和安全性；陈丽晓等[13]利用斑马鱼模型探讨了猪牙皂中7种三萜皂苷的毒性与结构之间的关系；杨雨婷等[14]以斑马鱼胚胎模型比较了广藿香油、广藿香醇和广藿香酮的毒性。目前，利用斑马鱼模型评价药物毒性已被国内学者广泛接受[15-17]。
斑马鱼引人注目的特点是快速、高通量、低成本筛选：用幼鱼可在1周内完成毒性快速检测；胚胎在母体外发育，体透明、易观察，可在96孔板中高通量进行；斑马鱼体小、生殖周期短、繁殖力强、易饲养、发育快、成本低，是大鼠的1/1 000；对DMSO耐受，易通过皮肤和腔道吸收药物[18-19]；斑马鱼与人的基因高度相似，与人类基因相比，具有高达87%的同源性[20-21]，基因信号传导通路、生理结构及功能等均与哺乳动物高度相似[22]。斑马鱼测试体系具备细胞模型高通量的特点，并兼顾在体动物模型近似人的整体生物反应[23]。另外，斑马鱼具有药物代谢的相关酶系，包括I相代谢酶和II相代谢酶，Goldstone等[24]研究发现，斑马鱼有94个细胞色素P450（CYP）基因，根据氨基酸序列的同一性可分为18个基因家族，同人类及其他哺乳动物一致。CYP基因中5-51家族有32个基因，其中大多数和人类的CYP基因直系同源，这些基因序列的高度相似预示着酶活性的一致性。Chung等[25]克隆了斑马鱼的Cyp1A基因，发现其在核酸序列上与虹鳟鱼、小鼠、人类对应的基因分别具有74%、57%和54%的同源性。Huang等[26]研究发现，斑马鱼有45个葡萄糖醛酸转移酶（UGT）基因，可分为3个家族：UGT1、UGT2、UGT5。由于斑马鱼具有完整的代谢器官系统和代谢酶系，以及与哺乳动物相似的系统及基因，这就为药物的安全性评价及代谢研究提供了理想的实验模型。在国外，斑马鱼毒性筛选已成为药物先导化合物发现过程的高内涵关键技术。在国内将斑马鱼用于药物毒性的研究已起步，将其用于中药毒性的研究正备受关注[27]。
1 斑马鱼模型用于药物毒性的研究基于斑马鱼的生理、基因、发育及培养等优势，在国外，斑马鱼幼鱼和成体鱼被广泛用于小分子化合物的大规模新药筛选研究，特别是急性毒性及早期毒性的高通量筛选研究，如神经、心脏、肾、消化道、生殖与发育毒性等。研究内容与方法可概括为3类：基于微观细胞、分子、基因水平；基于宏观组织、器官功能水平；基于多靶点、多指标水平的斑马鱼毒性研究（图 1）。
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图 1 模式生物斑马鱼在药物毒性评价中的应用示意图 Fig.1 Schemes of application of model organism zebrafish in drug toxicity evaluation |
1.1 基于微观细胞、分子、基因水平的斑马鱼毒性研究
基于微观水平的斑马鱼毒性研究有助于阐释宏观靶器官、靶组织的毒性机制，研究内容主要概括为3类：基于靶细胞的毒性研究；基于生物标志酶、标志蛋白及蛋白质组学的研究；基于生物标志基因、基因组学的研究。
1.1.1 基于细胞水平Dong等[28]以视网膜神经细胞的凋亡为指标，考察了三丁基锡（tributyltin，TBT）对斑马鱼早期阶段发育的影响。在致死浓度下，TBT增加了视网膜细胞及三叉神经元附近细胞的凋亡数量，用末端转移酶介导的切口-末端标记染色法（terminal transferase-mediated nick-end-labeling staining）检测。结果表明，在斑马鱼发育中，TBT首先诱导视网膜神经细胞凋亡，氧化应激可能参与了这一毒性反应。
Plachinta等[29]研究了常见6种冷冻保护剂对斑马鱼卵母细胞的毒性。将不同发育阶段的卵母细胞与含有不同浓度冷冻保护剂的Hanks培养液共孵育30 min，用台盼蓝（TB）染色、噻唑蓝（MTT）染色和生发泡破裂（GVBD）3种测试法评价卵母细胞活力。结果表明，冷冻保护剂对卵母细胞的毒性作用总体上随着浓度的增加而增加。测试法的灵敏度按MTT、TB、GVBD依次增强。GVBD与TB测试结果均显示冷冻保护剂的毒性按甲醇、丙二醇、二甲基亚砜、乙二醇、葡萄糖、蔗糖依次增强，卵母细胞对冷冻保护剂的敏感性似乎随发育成熟度增加而增强。Van der Ven等[30]采用组织形态测定法观察卵巢中卵黄母细胞和睾丸中嗜酸细胞（精原细胞），进一步用免疫组织化学确证，研究雌二醇（E2）和加氢甲基睾酮（MDHT）对斑马鱼内分泌的影响。
1.1.2 基于蛋白水平Senger等[31]以斑马鱼脑细胞膜中核苷酸双磷酸酶（nucleoside triphosphate-diphosphohydrolase，NTPDase）和细胞外5′-核苷酸酶（ecto-5′-nucleotidase）的活性为指标，观察氯化汞和醋酸铅对三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）水解作用的影响及机制。结果表明，Hg2+和Pb2+影响细胞外5′-核苷酸酶的活性，此酶是调控嘌呤信号通路的重要酶。Thompson等[32]研究了亚砷酸盐暴露对斑马鱼肝脏I相代谢酶（CYP1A）和II相代谢酶（EH、GSH）活力的影响。结果表明亚砷酸盐可能通过影响CYP1A酶活力调控苯并芘生物转化通路，其调控机制与翻译前、后均相关。
Goessling等[33]以肝脏脂肪酸结合蛋白（LFABP）为生物标志物，研究肝毒素对斑马鱼的肝损伤作用；Krone等[34]以热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）为细胞应激和副反应的生物标志物，观察到斑马鱼胚胎暴露于不同有毒物质中，HSP70的表达在斑马鱼胚胎特异组织中被激活；Seok等[35]以绿色荧光蛋白（eGFP）为环境污染物的标志物，eGFP的表达与砷暴露引起的斑马鱼胚胎形态异常相关，砷诱导的eGFP的表达模式与砷浓度相关。因此，可在稳定的转基因斑马鱼中构建HSP70/ eGFP报告基因系统，用以准确而又快速地检测斑马鱼胚胎多细胞体系的特异细胞毒性（cell-specific toxicity）和发育毒性。
Shrader等[36]研究了斑马鱼胚胎暴露于17β-雌二醇（17β-estradiol）和4-壬基酚（estrogen mimic 4-nonylphenol，4-NP）后其蛋白质组学的变化。用双向电泳和数字成像检测胚胎组织匀浆中蛋白表达的改变。结果发现对应的每个化合物做出反应的特定蛋白质较多，共同蛋白质却很少，表明2种化合物的反应途径是不同的。Kling等[37]研究斑马鱼暴露于六溴环十二烷（hexa bromocy clodo decane，HBCD）与四溴双酚A（tetra bromo bis phenol A，TBBPA）2种物质后的肝细胞蛋白质组学，以双向电泳及MALDI-TOF和FT-ICR分析鉴定，结果表明2种物质合用会产生意想不到的作用，蛋白质组学可作为检测药物混合效应的灵敏工具。
1.1.3 基于基因水平当代毒理学面临的挑战是作用机制阐释，这需要快速的、生物集成的能在分子水平上检测多种效应的生物测试系统。Muncke等[38]提出了基于斑马鱼致畸分子效应（MolDarT）的亚急性毒性测试法。卵黄蛋白原1基因（vitellogenin 1 gene，vtg1）mRNA水平可作为斑马鱼发育动情力的标志物。用逆转录实时聚合酶链反应检测斑马鱼受精卵暴露于17α-炔雌醇（17 alpha-ethinylestradiol，EE2）的vtg1 mRNA表达，结果表明，vtg1在发育的斑马鱼胚胎内的表达受EE2诱导，vtg1有可能作为MolDarT研究中的分子靶点。
Villeneuve等[39]用22 000个基因寡核苷酸微阵列检测了暴露于法倔唑的斑马鱼脑和卵巢组织的全面应答反应。在脑中转录水平的改变与分化、发育、DNA复制和细胞周期功能相关，在卵巢中转录水平的改变与细胞间黏附、细胞外基质、血管形成及发育功能相关。根据转录水平的改变推测斑马鱼通过放射状胶质细胞的增殖应对法倔唑引发的脑组织神经变性应激，而卵巢中基因表达的改变导致了因卵黄生成受损引发的卵母细胞成熟及排卵障碍。此研究为阐明下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴对内分泌活性化学物质（EACs）的应答反应提供了研究基础。
为了探讨四氯二苯并-p-二噁英（TCDD）对鱼胚胎心血管毒性的分子机制，发现与心血管功能相关的潜在基因，Handley-Goldstone等[40]构建了4 896个由成体斑马鱼心脏cDNA克隆组成的cDNA微阵列，已知200多个基因与发育、毒理和调控功能有关，用于检测斑马鱼早期胚胎暴露于TCDD的基因表达谱。结果发现TCDD能剂量依赖性地强烈诱导CYP1A和1B1，以及芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）基因组中的其他基因。重要的是，心脏肌节构件（包括心肌肌钙蛋白T2和多种球蛋白亚型）基因表达的改变与TCDD引发扩张型心肌病的假设一致。线粒体能量传递基因表达的增加也可能与心肌病相关。其他TCDD敏感基因包括脂肪酸、类固醇代谢酶、核糖体和信号转导蛋白。该研究为阐明TCDD的毒性机制提供了重要思路。
Pomati等[41]研究了混合药物对斑马鱼肝（ZFL）细胞的生长和转录调控作用。结果含13种成分的混合物明显抑制ZFL细胞的体外增殖。利用寡核苷酸的DNA芯片锁定14 000个斑马鱼转录体，获得了混合药物作用后的ZFL细胞基因表达谱。结果发现混合药物对ZFL细胞的作用涉及主要的代谢和细胞周期调控相关的转录抑制，同时还观察到用于识别蛋白激酶信号通路和DNA修复机制的相关基因表达上调，一些已鉴定的转录体可能与这些药物的全身毒性有关，而另一些则可能与药物的特定效应相关。这些药物也造成雌二醇受体β和雌二醇反应蛋白GREB1的超表达。此研究为这些药物的潜在毒性风险的发现提供了参考。
1.2 基于宏观组织、器官功能水平的斑马鱼毒性研究斑马鱼筛选技术为化合物对中枢神经系统、心脏、肠道功能等潜在脱靶效应提供非常早的预测，还可以用于早期一般药理学评价。
1.2.1 中枢神经系统（CNS）评价斑马鱼近年来成为中枢神经系统研究的重要模式生物。斑马鱼脑的整体组织与其他脊椎动物相似，有明确的定义域如下丘脑和嗅球、侧脑皮层的包围结构，看似与哺乳动物海马状突起同源[42]。此外，存在主要神经递质如胆碱能、5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素系统通路，并分布在整个大脑[43-44]。斑马鱼幼鱼最近已成为神经行为研究的焦点，如学习、睡觉、药物成瘾等[45-49]。发育正常的斑马鱼血脑屏障在受精后10 d起作用[50]。此外，P-糖蛋白转运体在受精后8 d出现于中枢神经系统内皮微血管中，这与P-糖蛋白底物从斑马鱼脑中外排的结果一致。这些研究显示可用斑马鱼建立研究药物神经活性的相关模型。
（1）运动行为（locomotor activity）：改进的活动测量实验可适于追踪斑马鱼的运动行为。斑马鱼幼鱼从受精后96 h开始能自由游泳，可测试其在含有待测化合物基质中的运动行为[51]。
镇静类化合物氯氮平（clozapine，12.5~50 mmol/L）、氟西汀（fluoxetine，4.6 mmol/L）、褪黑激素（melatonin，0.01~100 mmol/L）、地西泮（diazepam，0.01~100 mmol/L）和戊巴比妥（pentobarbital，0.01~100 mmol/L）可引起斑马鱼幼鱼运动障碍[45, 52-53]。1%~2%乙醇可引起斑马鱼活动过度，但在高质量分数（4%）时则抑制自发活动并引起毒性[54-55]。
（2）致惊厥、抽搐（convulsant and proconvulsant liability）：斑马鱼幼鱼在受精后7 d对戊四唑（pentylenetetrazole，PTZ）的反应呈浓度依赖，从增加游泳活动到快速“漩涡般”行为乃至全身性的强直阵挛发作。3阶段现象开始的潜伏期取决于惊厥剂的浓度。斑马鱼癫痫模型已得到验证[56]。此外，癫痫发作都伴随着中枢神经系统中C-fos基因的快速增量调节。利用视频跟踪系统，证实了13个已知抗癫痫药物能缓解并抑制PTZ诱导的癫痫发作[57]。用双盲试验对17种致癫痫化合物和8个阴性化合物进行测定，预测准确性达72%[58]。此法亦可用于潜在的抽搐剂筛查[59]。因此，斑马鱼用于化合物的致惊厥和致抽搐的早期预测是非常可能的。
（3）认知缺损（cognitive impairment）：目前已经建立了许多斑马鱼学习和认知模型，经过完善和验证，可用于测试中枢神经系统活性药物的潜在安全性。通过检测听觉刺激所致的受惊反应减少程度来研究斑马鱼幼鱼受精后7 d的非联想学习[60]。具有增强认知能力的药物如多奈哌齐（donepezil，3 mmol/L）、美金刚（memantine，30 mmol/L）和磷酸二酯酶-4抑制剂咯利普兰（rolipram，3 mmol/L）能调节斑马鱼适应听觉刺激。如用损害记忆的化合物如莨菪碱，可直接评测该系统是否可用于认知障碍和认知改善的检测。已有研究表明斑马鱼具有快速和可靠的学习能力，它们会游到池塘里的某些位置以避免诸如电击[61]或移动网[62]的不良刺激。
（4）依赖性（dependence liability）：条件性位置偏爱实验是目前评价药物精神依赖性的经典实验模型，也是广泛应用于寻找抗觅药行为的有效工具，已成为研究啮齿类动物和鱼类药物强化性的首选方法。遵循原理相同：允许动物在测试盒中随心所欲地探索，确定其在盒子的偏爱隔间，随后，将其暴露于最差偏爱隔间的药物中，然后评价动物的偏爱变化[47]。用此方法证实了可卡因（cocaine，5~15 mg/L）和右旋苯丙胺（damphetamine，40 mg/g）能引起成体斑马鱼的条件性位置偏爱反应[49, 63]。
另一种箱式实验是用受精后14 d的斑马鱼幼鱼研究吗啡（morphine，0.8 mmol/L）的强化性。在实验中，斑马鱼幼鱼可以有时间选择呆在含水或含吗啡的隔间中。实验前幼鱼已在含有吗啡的隔间中呆更长时间。用阿片受体拮抗剂纳洛酮（naloxone，0.5 mmol/L）或多巴胺受体D1的拮抗剂SCH 23390（9 mmol/L）预处理可减弱此种行为[64]。故成体斑马鱼和幼鱼都可用于行为学研究以评价药物作用。
1.2.2 视觉功能（visual function）由于斑马鱼视网膜与人类的非常类似，其视觉系统可用于评价视觉功能[65]。斑马鱼和人类一样具有丰富的彩色视觉，为测试啮齿动物的夜间活动提供了优势。斑马鱼胚胎的视觉系统发育非常快速，使其能够进食和回避捕食者，因此，幼鱼表现的视觉介导的行为可以用于视觉评价[66]。最早的可量化的视觉行为是视觉惊吓反应，表现在受精后68 h，幼鱼对光强度的突然减少而产生的快速移动[67]。这种行为反应自视网膜的光感受器和突触带形成时开始[68]。根据电生理学、形态学和行为标准，幼鱼在受精后5 d时视网膜系统发育完善[69]。
评价斑马鱼视觉功能的方法是利用其先天视反射的优势，例如已建立的光动反应和视动反应（optokinetic response and optomotor response，OMR）检测方法[70]。OMR测试可高通量评价化合物对斑马鱼视觉的影响，可能会成为首要的筛选法。斑马鱼OMR的验证试验正确地预见了8个化合物中6个化合物[氯喹（chloroquine，100 mmol/L）、氯丙嗪（chlorpromazine，10 mmol/L）、地西泮（diazepam，10 mmol/L）、尼古丁（nicotine，6.2 mmol/L）、哇巴因（ouabain，50 mmol/L）和苯妥英（phenytoin，100 mmol/L）]对斑马鱼视觉功能的影响，并以阿司匹林（aspirin）为阴性对照药物[71]。
1.2.3 听觉功能（auditory function）虽然鱼和哺乳动物的耳朵总体解剖学存在明显的差异，但它们的毛细胞结构与功能是高度保守的[72]。耳石内和斑马鱼侧线中的毛细胞在听觉方面发挥了至关重要的作用[73]。
筛选斑马鱼听觉缺陷的一个简单的方法是寻找异常的游泳模式。成年野生鱼维持一个正常直立位置，从上面几乎看不见他们的背腹轴和横向条纹。听觉系统突变鱼的特点是游泳兜圈子或成环，休息时横躺或上下颠倒[74]。
Bang等[75]设计了一个自动化、高通量的评价成体斑马鱼听力的筛选法，主要是靠观察触发听觉引起的惊吓反应。对于无反应的则进一步用放射分析法评价听觉系统的形态缺陷。而且这种方法已被应用于斑马鱼幼体。斑马鱼幼鱼受精后7 d受到听觉刺激后引起急剧的、可量化的自主活动增加[76]。
研究证明斑马鱼幼鱼经一些药物作用后其侧线毛细胞消失，如庆大霉素（gentamicin，5 mmol/L）、新霉素（neomycin，10 mmol/L）和顺铂（cisplatin，50 mmol/L），另外还报道了谷胱甘肽（glutathione，100 mmol/L）和其他抗氧化剂对经顺铂处理的斑马鱼听力有保护作用[77-79]。Tilton等[80]研究表明暴露铜、毒死蜱或其混合物后，斑马鱼出现游泳功能障碍。
1.2.4 心脏功能（cardiac function）人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指南（FDA，2005）要求任何候选药物在人体评价之前要进行体外实验测试其对hERG通道表达的作用及体内实验评价其对QT间期延长的影响。斑马鱼模型能够反映化合物通过多种机制影响QT间期延长的作用。斑马鱼幼鱼透明，不需要物理干预就可观察其心率、脉管系统和循环系统。斑马鱼胚胎心脏在受精后26 h开始跳动[81]，在受精后2 d成环[82]，在受精后3 d形成完整功能的血管树[83]，在受精后4 d心肌细胞增殖使心室壁增厚[84]，到受精后5 d心脏瓣膜发育[85]。人hERG和斑马鱼zERG具有较高的相似性，zERG仅在斑马鱼心脏的两房表达，具有99%人类同源基因的保守氨基酸序列。
敲除zERG基因导致典型的心律失常，2次心房跳动耦合1次心室跳动。用具有延长QT间期作用的药物测试，可使鱼胚胎（受精后3 d）引起这种特殊的呈浓度依赖性的心律失常：较低浓度药物诱导心动过缓，较高浓度导致退耦（2：1），有时呈更显著的去耦（3：1和4：1）、不规则性心律失常、纤维性颤动或完全心室阻滞[86-87]。该法能够筛选出已知阻止hERG的QT间期延长的药物如特非那丁（terfenadine）、西沙必利（cisapride）和匹莫齐特（pimozide），以及不影响hERG通道的化合物如YS-035、L-型钙通道阻滞剂。
Burns等[88]培育出在心肌表达绿色荧光蛋白的胚胎，使用显微镜扫描96孔板，同时用软件检测荧光心脏和像素强度变化，从而能读出95%幼鱼的心率。此法能够检测出已知延长QT间期的药物引起的心动过缓，有助于更早期检测斑马鱼心率。由此可见，斑马鱼模型具有早期心脏安全性评价的实用性和适用性[89]。
1.2.5 消化道功能（gastrointestinal function）斑马胚胎在受精后36 h开始肠道发育，在72和96 h时分别形成明显的前、后部消化道[90]。斑马鱼消化道早在受精后4 d肛门畅通和管腔开启后，开始滋生细菌[91-92]。与肠道同时形成的肝脏和胰腺也在4 d内发育[90]。因此，在受精后4~5 d的斑马鱼消化道形态已发育良好，外源性喂养在5 d时开始。由于幼鱼体透明，体内消化道的收缩可在显微镜下观察和定量[93]。
斑马鱼的肠道蠕动受肠神经系统的控制[94]。Berghmans等[57]测试了10个化合物对斑马鱼幼鱼受精后7 d的肠道蠕动影响，结果其中8个化合物表现出预期的收缩次数减少作用；此外，2种平滑肌松弛剂去甲肾上腺素和氯丙嗪会造成肠腔扩张。
一些药物对斑马鱼的作用与来自其他体内外模型或临床现有数据呈现出正相关。斑马鱼的肠道收缩便于观察和量化，意味着可用于评价临床最常见的不良反应（ADR）恶心呕吐[95]。
1.2.6 肾功能（renal function）硬骨鱼类前肾是一个简单的肾器官，由一对肾单位和在中线融合的2对肾小球组成，前肾小管通过颈状节和一对双向原肾管直接与肾小球相连，血液经原肾管直接滤出。斑马鱼胚胎在受精后40 h时肾开始过滤血液。肾小球结构虽然简单，但其具有在高等脊椎动物肾脏中的许多类型细胞，包括有孔毛细血管内皮细胞、足细胞和分化的肾小管上皮细胞[96]。
肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是评价肾功能的最好参数，菊糖清除率是测定滤过率的黄金标准。尽管斑马鱼肾脏结构简单，但庆大霉素对哺乳动物肾功能的不良作用也可在斑马鱼前肾中观察到。庆大霉素是一种具有哺乳动物肾毒性的氨基糖苷类抗生素。在斑马鱼胚胎受精后50~54 h时给心脏的静脉窦注射庆大霉素（10 mg/mL），可引起鱼的一些形态变化：心包和硬脑膜水肿，碎片累积于管腔内，肾小管和肾小球膨胀，以及肾小管受到泄殖腔挤压。此外，白细胞在肾小管周积聚，偶尔渗入肾小球。Drummond等[96]给鱼注射葡聚糖和菊糖，通过心脏荧光面积的变化来量化清除率。斑马鱼经庆大霉素处理后，其对葡聚糖和菊糖的清除率分别减少75%和67%；用另一种肾毒性药顺铂（1.5 mg/mL）处理，也显示肾小球滤过率发生变化。因此，尽管斑马鱼的简单前肾和复杂的人类肾脏不同，但对肾损伤的反应是保守的[97]。王雪等[98]研究发现大黄酸对马兜铃酸引起的斑马鱼肾脏损伤有一定的减轻作用。综上，评价药物影响斑马鱼肾功能的参数为形态学变化、炎症反应和肾清除率测定。
1.2.7 骨密度（bone density）斑马鱼的骨骼和哺乳动物相似，其形成也包括软骨内骨化和膜内骨化[99-100]。斑马鱼骨含成骨细胞和破骨细胞，前者负责骨架形成和骨矿化[101]，后者负责骨吸收[102]。Fleming等[103]建立了影响骨密度化合物的斑马鱼体内高通量筛选模型，实验用斑马鱼幼鱼（受精后5~10 d）在96孔板中进行，利用斑马鱼幼鱼的体积小和快速发育的优势，以茜素红染色来量化骨矿化。在幼鱼基质中加入类固醇泼尼松龙（25 mmol/L）造模后，则幼鱼骨矿化面积减少50%[104]。目前，国内实验室已成功利用斑马鱼骨质疏松模型开展了抗骨质疏松中药的相关研究[105-107]。
1.3 基于多靶点、多指标水平的斑马鱼毒性研究为了较全面、系统认识化合物的毒性，采用多靶点、多层次指标、多检测方法有机整合的研究方式正在成为斑马鱼模型应用于毒性研究的重要方向。特别是基因组学、蛋白质组学和代谢组学等技术的应用，为识别药物作用的详尽模式提供了巨大支撑。
1.3.1 对多种生物标志物和组织超微结构的检测，有助认识化合物对斑马鱼的毒性Hoffmann等[108]以性腺超微结构和内分泌生物标记物如血浆卵黄蛋白原、睾酮（testosterone）、11-酮基睾酮（11-ketotestosterone）、17β-雌二醇（17β-estradiol）为指标，采用组织病理学和RT-PCR技术检测，通过基因本体论（gene ontology，GO）分析，结果表明雌激素暴露能影响激素和维生素A代谢、类固醇结合、固醇类代谢及细胞生长等多种生物过程的基因，可作为检测雌激素暴露的生物标志物。
Sancho等[109]研究了斑马鱼暴露于戊唑醇时代谢、解毒及内分泌功能等多重生理性的变化，检测斑马鱼组织匀浆中3类指标：（1）代谢指标：葡萄糖、胆固醇、三酰甘油、乳酸、蛋白质；（2）解毒酶：γ-谷氨酰转移酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶；（3）内分泌功能指标：卵黄蛋白原。另测定半数致死浓度（LC50）和肥胖因子。结果表明戊唑醇对斑马鱼产生多重生理破坏作用。
1.3.2 对多组织基因谱的分析有助于提高对药物效应的认识Martyniuk等[110]用微阵列芯片和实时RT-PCR技术分析雄性斑马鱼暴露于EE2后的肝脏及终脑中基因组反应。结果发现将斑马鱼暴露于EE2（10 ng/L）21 d，肝脏中与雌激素暴露相关的生物标志物有vtg1、vtg3、雌激素受体α（esr1）和载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，apoA1），其mRNA水平有不同程度上调，而ATPase Na+/K+β1a（atp1b1a）mRNA水平下调。GO分析表明，肝、脑2个组织存在EE2调控的共同生物过程和分子调控功能（如电子传递和细胞交流），但基因分类却有组织特异性改变。
Gonzalez等[111]研究镉对斑马鱼的4个器官（鳃、肝、骨骼肌和脑）基因表达的影响。成年雄性斑马鱼在3中不同镉污染水中生长7和21 d。共选择了14个基因，它们涉及抗氧化防御系统、金属螯合、有机化合物主动外排、线粒体代谢、DNA修复、细胞凋亡，用实时RT-PCR技术进行基因定量分析。结果表明不同组织基因表达与调控具有差异性。
1.3.3 宏观与微观多重指标的有机结合有助于揭示药物的多重效应与机制Lancieri等[112]从死亡率、形态/组织学改变和钙调蛋白基因表达的变化研究氟甲喹对斑马鱼的胚胎毒性。将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度氟甲喹中35 d，所有浓度药物均显著提高鱼胚胎病死率，而且还导致鱼躯干变化和不对称鳍生成，特别是躯干的背腹侧和中横轴变薄，鱼软骨、肌肉和神经结构出现发育缺陷，肌节不规则、肌束不连续等肌肉组织的改变发生在鱼尾。以钙调蛋白信使RNA为探针的原位杂交分析发现，给药组鱼胚胎的躯干和背侧支脊神经信号强度显著降低。说明药物可能存在多重效应。Jin等[113-114]以细胞凋亡、氧化应激酶活性及基因表达为多层次指标，研究了阿特拉嗪、氯氰菊酯对斑马鱼肝脏、卵巢的毒性作用，揭示了氧化应激反应机制。
2 斑马鱼在中药毒性研究的思路与策略 2.1 中药毒性研究方法有待完善与丰富长期受中药有效和副作用小的思想影响，中药毒性的现代研究一直是比较薄弱的环节，当前中药毒性研究主要借鉴现代毒理学的技术和方法。近年来，中药毒性的研究正日益受到重视，体现传统中医理论的基于系统生物学、代谢组学等新思路、新方法的涌现使中草药的毒性研究迈上了一个新的高度。但也存在不足，主要表现在（1）体内毒性方面：体内毒性研究方法虽然经典、规范，但由于中药成分复杂，用药量较大，有时超过实验动物的胃容量，甚至引起动物死亡；中药毒性较低，有时甚至测不出半数致死量等数据，不能客观反映中药毒性实质；体内毒性研究劳动强度相对较大，难以实现高通量、快速毒性筛选。（2）体外毒性方面：体外毒性筛选方法缺陷在于实验体系无器官和组织的相互作用、无完整免疫系统和无血液循环，因此不能精确模拟体内环境；体外实验条件要求相对较高，成本高、耗时长，一般实验室难以进行；体外毒性研究缺乏中医理论的指导，难以体现中药作用整体观，其结果或结论具有较大的局限性和片面性，难以客观、科学地阐释中药毒性的实质。中药毒性研究方法有待丰富。
中药特别是复方为一个复杂的科学体系，化学成分复杂，通过多途径、多环节作用于多靶点产生的整体调节作用，从中药作用的整体观出发，研究中药在完整活体体系下的整体毒性作用，建立能兼容体内、体外毒性实验方法的优点，弥补它们不足的毒性研究模型将会是一个较理想的中药早期毒性筛选模型。采用器官、系统发育完善的模式生物斑马鱼进行中药毒性研究有希望实现这一目标。
斑马鱼特有的生物学特性决定了其具有作为成本-效益（cost-effective）毒理模型的独特优势，斑马鱼毒性评价方法已相对成熟并日臻完善，评价化合物数量由单一成分发展到多个成分同时进行，评价靶标由单一组织、器官发展成多个组织、器官同时进行，评价指标由宏观到微观多个层次表征，特别是近年来的代谢组学、蛋白质组学及基因组学的融入，揭开了斑马鱼毒性评价新篇章[115]。斑马鱼毒性评价多成分、多靶点的新理念正契合中医药作用整体观的特点，国内的相关研究在近5年开始探索[116-119]和快速模仿[120-125]，如何充分借鉴斑马鱼毒性研究的最新成果，建立符合中医药特点的斑马鱼毒性评价技术体系，有益丰富中药毒性评价方法，是亟待深入、系统研究的课题。
2.2 斑马鱼模型在中药毒性评价中的研究思路与策略根据本团队在中药毒性研究的积累，以及将斑马鱼用于中药毒性研究的初步探索，结合中药整体观思想，借鉴国外最新研究成果，建议该模型的建立可从以下几方面着手：研究对象的选择、给药与取样方法的研究、药物剂量选择、指标选择与检测、重现性试验、斑马鱼模型与小鼠急性毒性相关性（图 2）。
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图 2 模式生物斑马鱼中药毒性模型的建立与应用策略示意图 Fig.2 Strategy map of model establishment and application of model organism zebrafish in Chinese materia medica toxicity |
2.2.1 研究对象的选择
建议选择毒性及机制相对明确的中药为模式药，遵循由点到面，由简单到复杂的原则，依次选择单一成分、有效部位及中药提取物进行研究。
2.2.2 给药与取样方法的研究国外常用的给药方式为暴露于基质或注射。斑马鱼易通过皮肤和腔道吸收药物，对DMSO耐受，复杂中药成分更适于暴露给药方式，成体鱼和幼鱼均可，简单、易操作。斑马鱼在中药毒性评价中，通常采用将待测药物按一定浓度溶解在斑马鱼的培养池中，以暴露给药的方式进行实验。由于中药的特点，中药提取物常常会用不同溶剂（水、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇等）提取，在暴露给药时溶剂可能会对实验结果产生影响，可以尽量将提取物真空干燥或冷冻干燥，再溶解稀释，水溶性提取物直接用培养液稀释，极性小的样品先用DMSO助溶后，再用培养液稀释，空白对照组选用相应溶剂对照。
2.2.3 药物剂量的选择取斑马鱼（或胚胎）数10个，分别置于含有不同浓度有毒中药提取液中，随机分组，每组含斑马鱼（或胚胎）10个，药物浓度按10倍量稀释。观察24、48 h内受试鱼的反应情况，以确定正式实验的浓度范围，一般药物浓度（Cmax/Cmin）在5~50。
2.2.4 指标选择与检测根据中药多成分、多靶点的整体作用特点，建议遵循由面到点，由宏观到微观的原则选择检测指标。
（1）宏观指标选择与检测：以致死率、LC50值初步分析药物的毒性大小；以行为、功能变化判断毒性靶组织、器官；以鱼体及主要脏器心、肝、肾的病理检查判断组织病理学病变。
（2）微观指标选择与检测：选择生物标志内源性成分进行生化分析；进行生物标志蛋白、蛋白质组表达；生物标志基因、基因组表达的差异分析。根据研究内容选择检测方法，如双向电泳、数字成像、免疫组织化学、微阵列芯片和实时RT-PCR等技术，以期从微观层面揭示毒性机制。
2.2.5 重现性试验选取有毒成分、部位及提取物各一种样品为代表，进行重现性考察，平行3~5次实验。
2.2.6 斑马鱼模型与小鼠急性毒性相关性将斑马鱼与小鼠急毒模型的LC50值，行为、功能变化，病理组织学，内源性标志物，生物标志蛋白、基因等检测结果进行比对，探讨两者相关性，明确斑马鱼毒性模型表征中药毒性的合理性。
2.3 斑马鱼中药毒性评价模型的应用思路与策略斑马鱼中药毒性模型可有力辅助现有模型，用于中药安全性早期快速评价及毒性机制发现，进而用于与中药毒性相关的毒性物质基础、炮制减毒、以及配伍相反、相畏等规律研究（图 2）。
2.3.1 用于中药早期安全性快速评价常嘉等[126]研究发现建立的斑马鱼胚胎发育模型稳定，可应用于药物的早期毒性筛选。可考虑以《中国药典》收载的、临床常用的中药、名方中成药及有毒成分为代表。先期可选择毒性明确的研究对象，如有毒中药成分（如雷公藤甲素、马钱子碱、马兜铃酸）、有毒部位（雷公藤总苷、马钱子总碱）、有毒中药及复方（马钱子、雷公藤、木通、大戟及龙胆泄肝汤）等，采用所建立的斑马鱼模型进行毒性研究，主要检测致死率、LC50，行为功能及组织病理学，以发现早期毒性。进而对内源性成分、生物标志蛋白质（组）、基因（组）表达等指标进行差异分析，以探求毒性机制。这有助于验证斑马鱼毒性模型合理性与可靠性。在此基础上可将斑马鱼模型进一步用于毒性不明确的中药早期安全性评价，探索该模型的适用性。
2.3.2 用于与中药毒性相关的毒性物质、炮制减毒、以及配伍相反、相畏等规律研究以药味的不同组分与成分，不同炮制品，配伍相反、相畏、减毒药对等为研究对象，用斑马鱼模型进行毒性评价，以致死率、LC50、功能、病理检查、生化分析、蛋白质（组）、基因（组）等为检测指标，进行差异比较分析，判断致毒、减毒效应与机制。以深入探索斑马鱼毒性评价模型的效用。
3 模式生物斑马鱼中药毒性评价模型的展望用模式生物斑马鱼进行中药及其复杂体系的安全性快速检测研究，从而建立一种能体现中药作用整体观的中药毒性早期快速筛选新平台。与经典的在体急性毒性方法相比，模式生物斑马鱼最大限度地保留了在体活体的系统性，克服了在体动物实验强度大、周期较长的缺陷，同时克服了给药容积、浓度的限制，易于获得LC50值及生理、发育内源性生物标志物，生物标志蛋白、基因等指标变化，使中药毒性高通量快速筛选及毒性机制发现成为可能。与体外毒性研究相比，模式生物斑马鱼能有效地模拟在体的完整活体体系，克服了体外实验结果片面性、难以体现中药作用整体观的缺陷；克服体外实验条件要求高、成本高、耗时长、一般实验室难以进行的缺陷。模式生物斑马鱼代谢模型为中药复杂体系的安全性快速检测及毒性相关研究提供了一种简单的、模式的、生物的、系统的、高效的新方法。
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