昆仑雪菊（Kunlun snow daisy），学名蛇目菊，别名两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.，维吾尔语“古丽恰尔”^{[1, 2]}，是在新疆维吾尔药物中能与天山雪莲齐名并具有较高药用价值和独特功效的高寒野生植物。通过长期临床试验表明，长期冲泡饮用对糖尿病、高血压、高血脂以及冠心病患者有较显著的效果^{[3, 4]}。除此之外昆仑雪菊还具有减肥养颜、抗菌消炎、营养心肌、改善睡眠质量等功效^[5]。目前为止对昆仑雪菊有效成分分离提取的研究较多^{[6, 7, 8, 9, 10]}，富含黄酮类化合物^{[11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]}。现有研究证实，绿原酸及槲皮素、芦丁、木犀草素等黄酮类物质及其与糖结合形成的苷是昆仑雪菊花对心血管疾病及糖尿病等慢性疾病具有预防与保护作用的主要活性成分^[19]。买买提•艾买提等^[20]和赵文惠等^[21]利用RP-HPLC法对昆仑雪菊中木犀草素和绿原酸的量进行了测定。袁辉等^[22]利用HPLC法测定昆仑雪菊中绿原酸和黄芩苷的量。但是尚未见用HPLC法同时分离测定昆仑雪菊中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素量的相关文献报道。本实验以不同批次昆仑雪菊研究对象，建立HPLC-二极管阵列法同时测定昆仑雪菊中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素量的方法，以期为昆仑雪菊药材的质量控制和药理作用研究及新疆特色资源的充分开发利用提供科学依据。

槲皮素对照品（批号 100081，中国食品药品检定研究院）；芦丁对照品（批号0080-9705，中国食品药品检定研究院）；绿原酸（质量分数≥98%）、木犀草素（质量分数≥98%）对照品均购自Aladdin Chemistry Co. Ltd.；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。昆仑雪菊分4批（I～IV）采购于喀什东巴扎茶叶街，经喀什大学生物与地理科学系司马义教授鉴定为菊科（Asteraceae）金鸡菊属Coreopsis Linn. 多年生草本植物两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt. 的头状花序。

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（配有SPD-M20A二极管阵列检测器，DGU-20A5在线脱气机，LC-solution工作站）；KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XA-1型多功能粉碎机（江苏姜堰市分析仪器厂）；ZK-82B真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；赛多利斯BS224S型电子天平（德国）。

准确称取绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素对照品各5.0 mg于25 mL量瓶中，用甲醇完全溶解，稀释并定容至刻度，摇匀，得200 μg/mL各对照品储备液。分别准确吸取不同体积绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素对照品储备液于7个10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到7组混合对照品溶液，在冰箱里保存（6 ℃）。7组混合对照品溶液中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的质量浓度见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 混合对照品溶液中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的质量浓度 Table 1 Concentration of chlorogenic acid,rutin,quercetin,and luteolin in mixed reference solution 对照品 质量浓度/(μg·mL−1) 1 2 3 4 5 6 7 绿原酸 2.0 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 60.0 芦丁 5.0 10.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 槲皮素 1.0 2.0 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 木犀草素 0.5 1.0 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0

表 1 混合对照品溶液中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的质量浓度 Table 1 Concentration of chlorogenic acid,rutin,quercetin,and luteolin in mixed reference solution

准确称取干燥、粉碎、过筛（60目）的昆仑雪菊粉末1.0 g，加75%甲醇（25 mL），浸泡1 h，超声提取20 min，抽滤除渣，55 ℃减压浓缩滤液至干，放置室温，用甲醇定容至25 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液置于冰箱备用。

色谱柱：安捷伦HC-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.01%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序见表 2；体积流量1.0 mL/min；检测波长315 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

表 2(Table 2)

表 2 洗脱程序 Table 2 Elution procedure t/min A/% B/% 0.0 25 75 1.5 25 75 8.0 60 40 12.0 45 55 15.0 55 45 20.0 55 45 30.0 25 75

表 2 洗脱程序 Table 2 Elution procedure

分别吸取7组混合对照品溶液20 μL进样，按照“2.3”项下色谱条件测定其峰面积。每组重复6次，以对照品在混合溶液中的质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，实验结果表明峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。得到的线性回归方程、相关系数、线性范围见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 回归方程、相关系数、线性范围 Table 3 Linear regression equation,correlation coefficient,and linear range 组分 回归方程 相关系数 线性范围/(μg·mL−1) 绿原酸 A＝157 631.5 C＋25 463 0.999 8 2.0～60 芦丁 A＝128 634.3 C＋12 501 0.999 9 5.0～100 槲皮素 A＝202 546.2 C＋5 686 0.999 9 1.0～40 木犀草素 A＝125 638.1 C＋12 865 0.999 9 0.5～40

表 3 回归方程、相关系数、线性范围 Table 3 Linear regression equation,correlation coefficient,and linear range

混合对照品溶液，按“2.3”项色谱条件下连续进样5次，测定绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素峰面积的RSD分别为1.02%、0.95%、0.85%、1.38%和1.52%，表明仪器精密度良好。精密称取同一昆仑雪菊样品5份，每份约1.0 g，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算样品中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素质量分数的RSD分别为1.14%、0.85%、1.37%和1.62%，实验结果表明重复性良好。

精密吸取同一样品溶液，分别放置0、3、6、9、12 h后，按“2.2”项色谱条件下进样检测。计算绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素峰面积的RSD分别为0.96%、1.52%、1.41%和1.06%。结果表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

准确称取已测定的昆仑雪菊样品Ⅰ粉末5份，每份0.5 g，分别精密加入不同量的绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素对照品溶液，按“2.2”项方法制备加标样品溶液，按上述色谱条件进行测定，以外标法计算回收率。结果绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素平均回收率分别为102.4%、98.6%、103.5%、101.2%，RSD分别为1.05%、1.28%、0.95%、1.12%。

分精密吸取按“2.2”项下方法制备的昆仑雪菊供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.3”项色谱条件下进行测定。混合对照品和样品的HPLC色谱图见图 1，记录绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素面积积分值，代入回归方程计算，测定结果见表 4。

1-绿原酸 2-芦丁 3-槲皮素 4-木犀草素 1-chlorogenic acid 2-rutin 3-quercetin 4-luteolin 图 1 混合对照品(A)和供试品(B)溶液的色谱图 Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances (A) and samples (B)

表 4(Table 4)

表 4 样品中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的测定结果 Table 4 Determination of chlorogenic acid,rutin,quercetin,and luteolin 样品批次 绿原酸/(μg·g−1) 芦丁/(μg·g−1) 槲皮素/(μg·g−1) 木犀草素/(μg·g−1) Ⅰ 2 549.2 1 982.4 318.8 125.2 Ⅱ 2 487.1 2 034.2 309.1 107.3 Ⅲ 2 382.0 1 925.9 291.7 95.8 Ⅳ 2 408.1 2 157.1 348.8 82.7 平均值 2 456.6 2 024.9 317.1 102.8

表 4 样品中绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的测定结果 Table 4 Determination of chlorogenic acid,rutin,quercetin,and luteolin

利用二极管阵列检测器能够在一次运行中同时采集200、254、280、315、327、360 nm波长色谱图的特点，结合文献报道^{[23, 24]}，芦丁和槲皮素在315 nm波长下色谱峰的峰形对称，达到定量分析要求，因此，可以确定315 nm作为检测波长。

根据文献[25, 26]考察了不同比例的甲醇-乙酸，甲醇-0.1%磷酸水溶液，甲醇-0.01%磷酸水溶液，乙腈-磷酸水溶液为流动相，分别做等度洗脱或梯度洗脱，观察样品中各个有效成分的分离情况，当甲醇-0.01%磷酸水溶液作为流动相，梯度洗脱时，绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素峰形良好能达到基线分离，并且与其他杂质峰得到了良好的分离，峰形良好。因此，用甲醇-0.01%磷酸水溶液梯度洗脱分离绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素。

以不同浓度甲醇为提取溶剂考察了回流法、索氏提取法、浸提法、超声波法、解析法的不同方法的提取效果。结果显示，用75%甲醇超声提取20 min，浸泡1 h，再超声波提取20 min的方法，对绿原酸、芦丁、槲皮素和木犀草素的提取率最高，而且超声提取具有操作简单易行、能耗较低、快速高效、不破坏有效成分的特点。故选择75%甲醇超声提取20 min，浸泡1 h，再超声提取20 min作为昆仑雪菊中有效成分的提取方法。

昆仑雪菊以其高的观赏价值和奇妙的药用价值而备受青睐。昆仑雪菊资源丰富，开发利用前景光明。该方法简便快速、准确可靠、重现、精密度、稳定性、回收率都较好，是一种较好的测定方法。适用于同时测定昆仑雪菊中芦丁和槲皮素。为昆仑雪菊资源的深度开发利用、药用价值研究以及质量评价提供了科学依据。